来源：无缝克隆连接失败载体线性化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
挑板没菌、菌落全是空载体、测序总在接头处断掉，这三个场景你大概率都遇到过。问题经常不在插入片段，而在载体线性化。本文按无缝克隆实际流程，从酶切、PCR线性化、DpnI处理、同源臂、摩尔比、重组反应到转化测序，给你一套能直接照做的排查路径。覆盖Gibson、In-Fusion和同源重组类试剂盒。
第一步：快速排查低级错误
1. 酶切后没跑胶验证。取5 μL酶切产物，1%琼脂糖，120 V跑25 min，看是不是单一条带；有超螺旋带就