来源：细胞污染快速检测（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
细胞培养最怕什么？污染。培养基一浑，心就凉了半截。可有时候只是血清沉淀，你却把细胞全扔了。怎么快速判断是真污染还是虚惊一场？支原体这种隐形杀手又怎么揪出来？这篇教程从肉眼观察到PCR检测，手把手带你排查细菌、真菌、支原体污染。照着做，少扔几瓶细胞。
第一步：快速排查低级错误
别急着扔培养瓶。先查这4个新手坑。
1. 培养基变黄就扔？ 先看是否浑浊。如果只是变黄但清澈，大概率是细胞过密产酸，不是污染。解决：传代或换液，24小时后复看。
2. 看到黑点就慌？ 血清蛋白沉淀或细胞碎片，在显微镜下会做布朗运动，但不增殖。解决：换无血清培养基观察，若黑点不增多就是碎片。
3. 超净台没开紫外？ 操作前紫外照射30分钟，风机开10分钟。解决：养成开机先紫外+风机的习惯，别省这40分钟。
4. 手套不喷酒精？ 手是最大污染源。解决：戴手套后喷75%酒精，晾干再操作。移液器枪头也要喷。
第二步：分维度系统排查
按实验流程走，从外到内，从粗到细。
1. 培养基外观检查
现象：培养基浑浊、变黄、有絮状物或白点。
原理：细菌污染会产酸产气，培养基变黄且浑浊；真菌污染可见菌丝团，pH可能不变。
解决步骤：取1 mL培养基，12000 rpm离心2分钟，取上清测OD600。如果OD600>0.1，细菌污染。真菌的话，肉眼可见菌丝。
验证方法：取10 μL涂片，革兰染色，油镜观察。革兰阴性菌呈红色，阳性菌紫色。
2. 显微镜镜检
现象：细胞间隙有大量运动小点，或细胞形态改变、脱落。
原理：细菌比细胞小，在40倍物镜下可见点状运动；支原体不可见，但会让细胞拉丝。
解决步骤：取25 cm²培养瓶，直接镜下观察。若见大量杆状或球状颗粒，且培养基浑浊，细菌污染。若细胞形态拉丝但培养基清澈，怀疑支原体。
验证方法：DAPI染色，终浓度1 μg/mL，37°C避光10分钟，荧光显微镜下细菌DNA会亮。支原体则用Hoechst 33258，终浓度0.5 μg/mL，室温避光30分钟。
3. 培养箱环境检查
现象：多瓶细胞同时污染，不同细胞系无一幸免。
原理：培养箱水盘或CO₂管路污染，气溶胶扩散。
解决步骤：清空培养箱，水盘加饱和硫酸铜或高压灭菌水，紫外照射30分钟。CO₂管路用0.22 μm滤器。
验证方法：放一块琼脂平板在培养箱内，37°C过夜，看菌落。有菌落说明环境带菌。
4. 支原体检测
现象：细胞生长变慢，形态拉丝，但培养基不浑浊。
原理：支原体无细胞壁，体积小，普通显微镜看不见，常规抗生素无效。
解决步骤：取1 mL上清，100°C加热10分钟，用支原体16S rRNA引物做PCR。引物可站内设计，输入保守区序列。PCR条件：95°C 5分钟；95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，35循环；72°C 5分钟。
验证方法：Hoechst 33258染色，细胞核外出现荧光小点。或者用支原体检测试剂盒，按说明书操作。
5. 交叉污染检测
现象：细胞形态与预期不符，或生长速度突变。
原理：细胞系间交叉污染，比如HeLa污染其他细胞。
解决步骤：送STR鉴定。取细胞沉淀，提取DNA，做STR分型。
验证方法：比对ATCC或DSMZ数据库。相似度<80%说明交叉污染。
6. 病毒污染检测
现象：细胞无浑浊但状态差，频繁死亡。
原理：病毒污染不改变培养基外观，但影响细胞代谢。
解决步骤：用小鼠抗体检测试剂盒，或PCR检测特定病毒。比如鼠痘病毒。
验证方法：取上清接种敏感细胞，观察病变。或者送电子显微镜。
第三步：进阶疑难问题
支原体PCR假阴性怎么办？ 可能引物不匹配。换用不同靶标，如16S-23S ITS区。或者用支原体清除试剂处理2周后复检。别只做一次PCR就下结论。
内毒素污染影响蛋白表达？ 现象：细胞形态正常，但转染后蛋白产量低。原理：内毒素激活TLR4通路。解决：用鲎试剂法检测，换无内毒素血清和耗材。验证：转染后测蛋白活性。
病毒污染但不想扔细胞？ 比如鼠痘病毒。检测：用小鼠抗体检测试剂盒。解决：丢弃，彻底消毒。别冒险，病毒可能改变细胞基因组。
避坑总结+实操建议
3条核心结论：
1. 先看培养基是否浑浊，再决定扔不扔。清澈变黄只是过密。
2. 支原体检测每3个月做一次。别等细胞状态崩了才查。
3. 新细胞进实验室先STR鉴定。交叉污染比细菌更隐蔽。
2条日常好习惯：
- 每天开箱前用75%酒精喷手套，晾干再操作。
- 水盘每周换灭菌水，加饱和硫酸铜。
文末工具引导
如果你需要设计支原体检测引物，直接用站内引物设计工具，输入16S rRNA保守区，自动出引物。污染后要做蛋白表达？试试密码子优化和可溶性优化工具，帮你救回实验。别让一瓶污染毁了一周。