来源：蛋白电泳迁移异常还原剂（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做SDS-PAGE或Western blot，最怕条带位置不对。明明加了DTT，还是出现二聚体、多聚体、拖尾或弥散。别急着换抗体或重跑。大概率是还原剂环节出了问题。本文从低级错误到进阶疑难，覆盖还原剂种类、浓度、pH、温度、氧化、烷基化等排查路径。给你具体参数和验证方法，照着做就能定位。
第一步：快速排查低级错误
1. 还原剂忘加或加错？直接看样品缓冲液，DTT终浓度要到100 mM，β-巯基乙醇要到5% (v/v)。解决：现用现加，别依赖“应该加了”。
2. 还原剂失效？DTT反复冻融会氧化，β-巯基乙醇易挥发。解决：DTT分装-20°C，β-巯基乙醇每月换新，使用前室温平衡。
3. 煮沸时间不够？95°C至少5分钟，膜蛋白可延长到10分钟。解决：用沸水浴，别用金属浴温度虚标。
4. 样品太浓，还原剂不够？每10 μL样品至少加5 μL 4×上样缓冲液。解决：稀释样品或提高还原剂浓度至200 mM DTT。
第二步：分维度系统排查
先看样品制备。现象：还原后仍有二聚体，条带在预期分子量两倍处。原理：二硫键没被完全打开。解决步骤：1）检查样品缓冲液pH，Tris-HCl要62.5 mM pH 6.8。2）DTT加到100 mM，β-巯基乙醇加到10% (v/v)。3）95°C煮沸10分钟，中间涡旋一次。验证方法：跑非还原电泳对比，还原后二聚体消失才算