来源：细胞培养污染检测支原体PCR（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
细胞养着养着就变慢、飘、黑点？支原体污染最会装。PCR跑完没带、弱带、假阳性，一天白干。本文覆盖取样、提取、PCR体系、程序、对照、进阶疑难，给你能直接照做的排查路径。别猜，按顺序来。
第一步：快速排查低级错误
1. 取错样本。支原体主要在上清，你只刮细胞沉淀？直接取传代后48-72 h的1 mL上清，12000 g离心5 min，取上清。解决：弃沉淀，留上清。
2. 漏加模板。PCR体系配完忘了加DNA？设置加样顺序，先加水、缓冲液、引物、酶，最后加模板。解决：每管换枪头，加完标记。
3. 阳性对照失效。阳性对照没带，整批结果不可信。阳性对照用已知污染细胞上清提取的DNA，或10^4 CFU/mL支原体DNA。解决：阳性对照和样本一起提取，不要直接加质粒。
4. 阴性对照污染。水对照出带，试剂或气溶胶污染。解决：试剂分装成小份，每次新开，UV台操作，开盖前瞬时离心。
第二步：分维度系统排查
按流程走，别跳步。
1. 样本采集与处理
现象：阳性对照有条带，样本无带。原理：支原体滴度随培养时间变化，刚换液后上清中支原体少。解决：取传代后48-72 h上清，1 mL，12000 g离心5 min去除细胞碎片，取200 μL用于提取。若细胞密度低，延长到96 h。验证：用已知污染上清做10倍梯度稀释，测检测限。短句：别取刚换液的。
2. DNA提取
现象：所有管都无带，包括阳性对照。原理：支原体DNA量少，酚氯仿残留乙醇、盐会抑制Taq酶。解决：用柱式提取试剂盒，加1 μg carrier RNA，洗脱30 μL，55°C孵育2 h或过夜。直接煮沸法：上