来源：测序峰图杂合双峰模板二级结构（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
样本送出去三天，峰图回来一看——同一个位置两个峰叠在一起，像被谁踩了一脚。重新挑菌、重做PCR，还是老样子。多数人第一反应是"杂合突变"，可很多时候真凶是模板二级结构。这篇教程按"先排低级错误、再按流程分模块、最后啃硬骨头"的顺序，把双峰的判断、验证、解决动作一次讲完，试剂用量和温度都给到具体值，照着做就行。
第一步：先别怀疑人生，这几个低级错误3分钟能排掉
1. 挑菌挑到两个克隆。 平板划线不纯，枪头一戳带起两个菌落，测出来必然双峰。重新划线，挑单克隆，37°C摇菌12–16 h再送。
2. 模板浓度不对。 质粒模板给200–500 ng/反应，PCR产物给10–30 ng/反应；超过1000 ng峰矮基线高，低于20 ng直接没峰。用Qubit或Nanodrop重测，按值稀释。
3. 引物量超了。 测序引物3.2 pmol（10 μM储液取0.5 μL）就够，加多了出杂峰和引物峰。核对体积，别凭手感。
4. 上机样品有气泡或残盐。 96孔板里留个气泡，毛细管进样体积就不稳。短暂离心1 min，确认无泡再上机。
第二步：按流程分模块，逐个维度排查
模块一：模板制备——二级结构就在这里埋雷
1. 现象：双峰从固定位置开始，往下游100–200 bp逐渐变成乱峰甚至提前终止，换引物也一样。
原理：GC含量高于70%或存在反向重复时，单链模板会自身回折成发夹、茎环，BigDye里的Taq FS走到茎环处停顿或滑移。
解决步骤：①测序反应补加DMSO至5%（v/v），或甜菜碱1 M；②质粒模板先95°C变性5 min，立刻插冰浴2 min再配反应；③仍不行就换含7-deaza-dGTP的体系，削弱Hoogsteen配对；④退火温度从50°C提到60°C，跑55/58/60°C梯度。
验证：同一模板做"加DMSO"和"不加DMSO"两组平行，跑同一板毛细管，看双峰是否塌成单峰。
模块二：模板混杂——真杂合还是污染？
2. 现象：双峰只出现在一个位点，上下游干净，两峰高度比约1:1且稳定。
原理：真实杂合突变，或者两个等位基因、两个菌落混在一管；阳性模板污染也长这样。
解决步骤：①重新划线挑3个单克隆分别测；②换反向引物再测一次；③PCR产物做TA克隆后挑10个克隆测序。
验证：正反向引物在同一位置都出互补双峰，才是真杂合；只有单向出现，大概率是结构或污染。
模块三：引物本身——发夹和二聚体
3. 现象：峰图起始30–60 bp内就开始乱，后面反而变干净。
原理：引物3'端自身回折，或两条引物互补形成二聚体，退火时延伸产物长度不齐。
解决步骤：①引物丢进设计软件跑二级结构，ΔG高于-3 kcal/mol才算安全；②换成