来源：His标签蛋白洗脱少咪唑竞争（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完SDS-PAGE，泳道里空空如也，或者洗脱峰矮得像个小土包。上样前明明看见菌液有表达，破菌上清也有带。问题出在哪？多半是咪唑竞争没打够，也可能蛋白压根没挂上柱。这篇按实验流程拆成上样、洗涤、洗脱、洗脱后四段，每一步都给你"怎么判断→怎么验证→怎么解决"，顺带聊两个反常识的疑难情况。照着走一遍，八成能找到漏点。
第一步：先别急着怀疑人生，看这4个低级错误
1. 咪唑母液的pH没调。 8 M咪唑母液直接拿水配，pH常年在9.5以上，稀释后洗脱液pH飘；反过来用HCl调过头到6.0，洗脱效率直接砍半。调回pH 8.0再上柱。
2. 洗脱液浓度算错。 把200 mM写成20 mM，或者母液稀释倍数算反。20 mM和200 mM差一个数量级，跑胶能看出来。
3. 柱子用太多次，Ni²⁺掉光了。 流出液发绿、柱床变白、上样后挂不住。0.1 M EDTA strip后重新charge。
4. 收集管拿错。 Flow-through和Wash里其实有你的蛋白，洗脱管里当然空。跑胶时把每一步都点一孔。
第二步：按流程四段排查，别跳步
一、上样结合段：蛋白根本没挂上
1. 缓冲液里混了螯合剂或还原剂。
现象：Flow-through里目标带和上样前一样深，柱子像没起作用。
原理：EDTA、EGTA、柠檬酸直接抢Ni²⁺；1 mM DTT或β-巯基乙醇也能慢慢把Ni²⁺还原下来，5 mM以上基本宣判死刑。
解决：裂解液和结合缓冲液里，EDTA和柠檬酸清零，DTT压到0.5 mM以下，或者换成TCEP 0.2 mM。想要还原环境又不想动镍柱，TCEP更稳。
验证：取1 mL上样流出液测蛋白浓度，和上样前比。差值小于10%，说明没挂上。
2. pH不在合适区间。
现象：挂载量只有预期一半，怎么增加上样量都没用。
原理：组氨酸咪唑环的pKa约6.0，pH低于7.0时质子化程度高，与Ni²⁺配位能力下降。结合缓冲液pH应落在7.4–8.0。
解决：50 mM Tris-HCl pH 8.0，或20 mM磷酸钠 pH 7.5。配完实测，别信试纸。
验证：同一批样品分别用pH 7.0和pH 8.0缓冲液上样，比洗脱峰高度。
二、洗涤段：目标蛋白被提前冲走
3. 洗涤咪唑浓度给高了。
现象：Wash组分跑胶很浓，洗脱反而很淡。
原理：不同蛋白的标签可及性不同，有些蛋白20 mM咪唑就开始脱落。教科书说的"40–60 mM洗"是通用值，不是你的值。
解决：做咪唑梯度洗，10、20、30、40、60 mM各收一管，跑胶找出目标蛋白从哪管开始漏。洗涤浓度卡在它下面一档。
验证：