来源：核酸提取A260/A280偏低蛋白残留（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
提核酸最怕什么？不是没提出来，是提出来了但比值难看。A260/A280卡在1.5、1.6，跑胶点样孔亮得刺眼，下游PCR时好时坏。你第一反应是"柱子有问题"？先别急着换试剂盒。这篇文章把蛋白残留从裂解到洗脱的常见原因拆成三步排查：先看低级错误，再按实验流程分模块定位，最后说几个让老手也翻车的疑难情况。每一步都给你判断方法和具体参数，照着做就行。
第一步：快速排查低级错误
新手最容易在这些地方栽跟头，花两分钟先排除，别一上来就怀疑试剂盒。
1. 比色皿没擦干净或用了普通塑料皿 —— 260 nm是紫外区，塑料皿吸光，外壁指纹也吸。解决办法：换石英比色皿或微量UV板，加样前用擦镜纸擦干外壁，空白用TE或洗脱液，别用水。
2. 样品太浓没稀释 —— A260读数超过1.0甚至2.0时，仪器已经非线性，比值会假性偏低。解决办法：取2 µL样品加98 µL TE稀释50倍，让A260落在0.1-1.0之间重测。
3. 仪器模式选错 —— 测的是DNA却选了RNA模式，或者选了ssDNA模式，换算系数和比值计算都偏。解决办法：在仪器里选对核酸类型，dsDNA、RNA、ssDNA各有各的系数。
4. 洗脱液本身不是空白 —— 有人用TE洗脱却拿水做空白，A230和A280基线全歪。解决办法：空白液和洗脱液用同一管，别混。
第二步：分维度系统排查
低级错误排完，比值还是1.5-1.7，那就按流程往下走。下面六个模块，每个都给你现象、原理、操作和验证，从头往下捋。
1. 裂解不彻底，蛋白没变性
现象：产量正常，但A260/A280只有1.5-1.6，跑胶点样孔有亮带。
原理：细胞没完全裂开，蛋白没被变性剂打开，就会和核酸一起留在水相或结合到硅胶膜上。蛋白酶K没起作用，蛋白更是原封不动。
解决步骤：组织样本先加裂解液，按20 mg组织加200 µL裂解液的比例，再加蛋白酶K到终浓度200 µg/mL，涡旋10秒。56°C孵育30分钟，中途每10分钟颠倒混匀一次。细胞样本可省蛋白酶K，但裂解液里SDS要到1%，涡旋15秒，室温静置5分钟。
验证方法：取5 µL裂解液加95 µL水，看是否澄清；黏稠拉丝说明DNA没打断，补加蛋白酶K再孵育15分钟。
2. 酚氯仿抽提水相带蛋白
现象：抽提后中间层白色絮状物厚，吸上清时枪头一抖就带进去。
原理：酚氯仿让蛋白变性留在有机相和界面，但界面蛋白太多时，水相体积大、吸得太猛就会交叉污染。
解决步骤：加等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），涡旋15秒，12000 g、4°C离心10分钟。吸上清时枪头贴壁，离界面至少2 mm，宁少勿多。重复抽提一次，第二次用氯仿:异戊醇（24:1）去残酚。
验证方法：取1 µL上清加9 µL水，测A260/A280，应大于1.8；若仍低，再做一次氯仿抽提。
3. 洗涤不彻底，乙醇浓度不够
现象：A260/A280在1.7左右晃，A260/A230也低，说明盐和蛋白都没洗干净。
原理：70%乙醇能沉淀核酸、溶解部分蛋白和盐，但浓度低于70%时蛋白溶解度上升，洗不干净；洗涤次数少，膜上残留照样拉低比值。
解决步骤：用新鲜配的80%乙醇，每次加500 µL，12000 g离心1分钟，重复两次。最后一次空管离心2分钟，开盖室温晾3-5分钟，别晾过头，否则难溶。
验证方法：洗脱后测A260/A230，大于2.0说明盐去干净了；若仍低，再洗一次。
4. 洗脱条件太粗暴
现象：浓度不低，比值却低，二次洗脱的比值反而比第一次高。
原理：低离子强度、低pH的洗脱液会把非特异吸附的蛋白一起洗下来。用错洗脱液，等于把膜上杂质重新溶解。
解决步骤：用TE（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）或NF水，预热到60°C，加50 µL到膜中央，静置2分钟，12000 g离心1分钟。想提高浓度可减到30 µL，但别低于20 µL。
验证方法：收集第一次洗脱液后，再加50 µL洗脱液做二次洗脱，分别测比值。第二次明显更高，说明第一次带下了杂质。
5. 样本本身蛋白太高
现象：肌肉、肝脏、植物根茎样本，反复抽提三四次，比值死活上不了1.8。
原理：起始量太大，裂解体系饱和，蛋白酶K相对不足，蛋白降解不彻底。高多糖多酚样本还会和蛋白一起共沉淀。
解决步骤：把起始量砍到10-20 mg，裂解液加倍到400 µL，SDS提到1.5%，蛋白酶K孵育延长到1小时。植物样本可在裂解液里加1% PVP-40和0.2% β-巯基乙醇。
验证方法：取1 µL提取产物跑0.8%琼脂糖凝胶，点样孔亮带消失说明蛋白去干净；仍有亮带，重复氯仿抽提。
6. 交叉污染或仪器二次污染
现象：同批样本比值集体偏低，连空白都偏高。
原理：比色皿残留蛋白、枪头污染、离心机转子带样，都会让结果整体偏移。
解决步骤：比色皿每次测完用0.1 M HCl浸泡5分钟，水洗，乙醇冲，倒置晾干。枪头用带滤芯的。离心机转子用75%乙醇擦一遍。
验证方法：用已知浓度的标准品（如λDNA 50 ng/µL）测一次，比值应在1.8-1.9；偏离说明仪器或比色皿有问题。
第三步：进阶疑难问题
有些情况比值看着还行，但蛋白残留其实不低，得靠别的办法判断。
情况一：A260/A280正常，A260/A230却低。 比值1.8但A230只有1.5，大概率是胍盐或乙醇残留，不是蛋白。用BCA法测一下蛋白浓度，若低于检测限，就不用折腾。解决：多洗一次，空转2分钟，换TE洗脱。
情况二：RNA样本RNA酶没灭活，蛋白复合物残留。 RNA提取时A260/A280 1.6，加RNase A 37°C处理30分钟后再酚氯仿抽提，比值能回到1.9以上。原理是RNase A把RNA从蛋白复合物上剥离。
情况三：微量样本（总量<1 µg）比值不可靠。 NanoDrop测1 µL，浓度低于20 ng/µL时比值波动±0.2都正常。改用Qubit测浓度，或把样本浓缩到50 µL再测。别拿微量样本的比值当判决书。
避坑总结+实操建议
三条核心结论。第一，A260/A280低于1.7先看裂解和洗涤，八成的蛋白残留出在这两步。第二，比值低不等于不能用，下游PCR能出条带就可以继续，别为了一个数字反复纯化把样本搞没了。第三，不同样本分开处理，肌肉和细胞用同一套参数，总有一个吃亏。
两条日常好习惯。每次提核酸前把蛋白酶K和裂解液室温平衡，别从-20°C拿出来直接加，低温会降低消化效率。洗脱液分装成500 µL一支，用一次扔一支，避免反复冻融导致pH漂移。
比值调好了，下一步往往是设计引物验证模板、或者把提取的RNA反转录后做蛋白表达。引物设计可以用站内工具，输入序列自动出Tm和二级结构；蛋白表达前想提高可溶性，试试密码子优化和可溶性优化工具，把N端信号肽和稀有密码子一起处理掉。提取是起点，下游顺了才算真顺。