来源：质粒提取基因组污染碱裂解（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
质粒提取得挺顺，A260/A280 1.8，结果0.8%胶上一看，高分子量条带压着孔，酶切拖尾，转染效率还掉。大概率是碱裂解时基因组DNA冲进了质粒。别急着换柱子。本文把菌液、裂解、中和、上清、沉淀、验证全流程拆开，给你现象、参数和验证动作。照着排，通常20分钟定位，半天内改回来。
第一步：快速排查低级错误
1. 菌液过夜超过16小时，OD600冲到4以上。死菌一多，基因组就往外漏。重新接单克隆，37°C 220 rpm培养12-14小时，OD600控制在2-3。
2. 溶液II配太久，NaOH浓度漂了。裂解不足或过头都会带基因组。溶液II现配现用，0.2 M NaOH + 1% SDS，室温避光别超过1周。
3. 裂解时涡旋或颠倒太猛，超过5分钟。基因组被打断，和质粒一起留在上清。轻柔颠倒4-6次，室温2-3分钟，直接加溶液III。
4. 吸上清时碰到白色沉淀，还贪体积。沉淀里全是基因组、SDS和蛋白。吸700 µL就停，宁可少吸，别贴沉淀。
第二步：分维度系统排查
1. 菌液培养与收集。现象：0.8%琼脂糖胶在孔附近出现>10 kb高分子量条带，质粒条带反而偏弱。原理：过夜培养超过16小时或OD600>4，部分菌死亡裂解，基因组DNA释放到培养基，碱裂解后与质粒共沉淀。解决：接种单克隆到5 mL LB，37°C 220 rpm培养12-14小时，OD600 2-3；取1.5-3 mL菌液，12000 rpm离心1分钟，弃上清尽量干。验证：测OD600，同时跑不同培养时间的胶，看高分子量条带是否随培养时间变深。
2. 溶液II裂解强度与时间。现象：加溶液II后裂解液变粘稠、拉丝，跑胶基因组条带很强。原理：NaOH和SDS破坏细胞膜，也让基因组变性。裂解超过5分钟或剧烈振荡，基因组断裂成大片断，无法在溶液III中完全共沉淀。解决：溶液II 200 µL，轻柔颠倒4-6次，室温2-3分钟，最多5分钟；禁止涡旋。验证：观察粘稠度，用秒表计时，做2分钟、5分钟、10分钟对比。
3. 溶液III中和与冰浴。现象：沉淀松散，上清带丝，离心后管底白色物不紧凑。原理：醋酸钾中和碱，SDS沉淀，基因组与蛋白共沉淀。冰浴不足5分钟或中和不充分，沉淀不完全，基因组留在上清。解决：加溶液III 300 µL，立即颠倒6-8次，冰浴5-10分钟；12000 rpm 4°C离心10分钟。验证：沉淀应紧凑白色，上清清亮；若上清仍粘，补冰浴5分钟再离心。
4. 上清转移与纯化。现象：吸头碰到沉淀，或上清转移后胶上高分子量条带明显。原理：沉淀中含基因组、SDS和蛋白，转移带入就污染。解决：转移上清约700 µL，不要贪多；可重复离心2分钟再吸一次。加RNase A 10 mg/mL 2 µL，37°C孵育30分钟；再用酚氯仿、氯仿各抽提1次，12000 rpm离心5分钟。验证：跑0.8%胶，看高分子量条带是否减少；测A260/A280应在1.8-1.9。
5. 沉淀洗涤与溶解。现象：异丙醇沉淀后可见白色絮状，基因组共沉淀。