来源：限制性内切酶酶切弥散缓冲液（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑完胶一看，条带糊成一团，酶切位点该出的小带没出来，泳道底部还拖着尾巴。酶切失败的原因里，缓冲液与体系配比占了大头，DNA本身和电泳条件也能背锅。下面这份排查清单，从新手最容易踩的低级坑开始，一路查到双酶切缓冲液折衷和星号活性这种进阶问题，按实验流程走一遍。
第一步：快速排查低级错误
1. 缓冲液加错或没稀释到位。10×缓冲液必须稀释到1×，50 μL体系加5 μL，不要凭感觉倒。NEBuffer 3.1要求100 mM NaCl，用rCutSmart去配高盐酶，酶活可能只剩10–20%。
2. 酶加太多。酶保存液里甘油占50%，20 μL体系加2 μL酶，甘油就到5%。超过5%就等着出星号活性，多出杂带。
3. 稀释用水选错。用ddH₂O，别拿TE或DEPC水顶。EDTA会螯合Mg²⁺，而Mg²⁺是酶催化的必需辅因子，酶直接罢工。
4. 体系配液顺序颠倒。正确顺序是水→缓冲液→DNA→酶。酶最后加，加完轻弹管壁两下，瞬离3秒，不要涡旋。
第二步：分维度系统排查
1. 缓冲液盐浓度与酶不匹配
现象：切不完全，主带上方残留原质粒，泳道里弥散一片。
原理：限制酶活性依赖离子强度。高盐酶在低盐环境活性下降，低盐酶被高盐抑制，活性一低，部分位点切不动，跑胶就是弥散加底带。
怎么判断：做一个不加酶的对照管——DNA加缓冲液加水，37°C孵育1小时。对照管也弥散，说明问题在DNA或电泳，不在酶。
解决：查酶厂家的缓冲液对照表。单酶切用它的最适缓冲液，50 μL体系配DNA 1 μg、10×缓冲液5 μL、酶10 U，补水到50 μL，37°C