来源：大肠杆菌包涵体复性低尿素稀释速率（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
包涵体溶解了，稀释复性也做了，上清却没多少目标蛋白。你盯着SDS-PAGE，心里只剩一句：又白干了。低尿素稀释速率这个坑很常见：尿素降得太慢，蛋白在2–4 M窗口停太久，疏水面互相贴，聚成沉淀。本文从低级错误、按流程系统排查到进阶疑难，给你可落地的参数和验证动作，帮你把复性回收率拉回来。
第一步：快速排查低级错误
1. 尿素没完全溶解？ 8 M尿素现配，50 mM Tris-HCl pH 8.0，室温搅拌30 min，12000 rpm离心20 min取上清。肉眼无颗粒再往下做。
2. 稀释缓冲液pH漂了？ 尿素会拉低pH。用1 M Tris-HCl pH 8.0母液，终浓度50 mM，加1 mM EDTA，测到pH 8.0再稀释。
3. 起始蛋白浓度太高？ 溶解后先稀释到0.05–0.1 mg/mL。超过0.5 mg/mL，低稀释速率下大概率聚。
4. 稀释时温度太高？ 全程4°C，蠕动泵0.5–1 mL/min