来源：STAR Protoc | 编译：DNA Lab Space
酵母是合成生物学的核心底盘细胞，但CRISPR编辑的入门门槛往往卡在guide RNA克隆这一步。传统做法要用限制性内切酶和连接酶把guide序列装进质粒，步骤繁琐、效率波动大。这篇发表在STAR Protocols上的工作给出了一条更直接的路径——用PCR产物替代酶切连接，把sgRNA“装”进Cas9质粒，全程只需G418筛选和常规转化。方法本身不追求颠覆性创新，却把实验周期压缩到以天为单位，尤其适合需要快速迭代多个guide位点的场景。
研究背景
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的CRISPR-Cas9编辑通常需要两个核心组件：表达Cas9蛋白和sgRNA的质粒，以及提供修复模板的HDR供体DNA。传统构建sgRNA质粒依赖限制性内切酶酶切和T4连接酶连接，这一步骤不仅耗时，还常常因为酶切不完全或连接效率低而失败。对于需要同时测试多个靶位点的实验，这种“每个guide都要重新克隆”的模式成了明显的瓶颈。
本论文提出的方案把guide插入方式从“酶切-连接”改为“PCR产物直接转化”。具体做法是设计一段带有guide序列的PCR引物，通过PCR把sgRNA序列扩增出来，然后利用酵母体内同源重组机制，让PCR产物与线性化的Cas9质粒在酵母细胞内完成重组和环化。这样一来，省去了体外酶切和连接步骤，也绕开了大肠杆菌克隆环节的反复挑菌和测序验证。
论文的通讯作者Isom实验室长期关注基因编辑工具在真核细胞中的应用优化。这项工作的定位很明确：不是开发新的Cas9变体或新的编辑策略，而是把现有CRISPR工具的“操作体验”做顺——让guide构建变得像PCR一样简单，从而降低酵母基因编辑的技术门槛。
研究方法
整个实验流程可以拆解为四个阶段：sgRNA和HDR供体设计、guide插入Cas9质粒、大肠杆菌中验证质粒、以及酵母共转化。论文对每个环节都给出了具体操作参数。
培养基配制是第一步。 用于大肠杆菌筛选的LB液体培养基配方为：LB肉汤粉末25 g/L，加ddH₂O定容至1 L，121°C高压灭菌20–30分钟。待冷却至约55°C后，加入无菌过滤的卡那霉素储存液（50 mg/mL）至终浓度50 μg/mL，轻轻混匀。不含抗生素的LB液体培养基可在室温保存最多6个月，含卡那霉素的培养基则需4°C保存，最多1个月。LB琼脂平板在液体配方基础上额外加入Bacto琼脂1.5%（w/v，即15 g/L），灭菌后冷却至55°C左右加入卡那霉素，倒板后室温凝固，4°C保存同样不超过1个月。
酵母培养使用YPD液体培养基：葡萄糖2%（w/v，10 g/500 mL）、蛋白胨2%（w/v，10 g）、酵母提取物1%（w/v，5 g），ddH₂O定容至500 mL，121°C灭菌15–20分钟，室温保存最多6个月。用于转化后筛选的YPD + G418平板在基础配方中加入Bacto琼脂2%（w/v），灭菌冷却后加入G418储存液（50 mg/mL）至终浓度500 μg/mL。
sgRNA与HDR供体设计遵循标准规则。 sgRNA序列需针对目标位点设计，同时确保PAM序列正确。HDR供体则需包含与编辑位点两侧同源的序列，长度和位置设计以能引导正确修复为准。论文特别提到，供体设计中应包含沉默突变来破坏PAM序列——这么做是为了防止编辑完成后Cas9再次切割已修复的位点，提高编辑成功率。
guide插入采用PCR策略。 与传统酶切连接不同，这里通过PCR引物直接引入guide序列，扩增产物与Cas9质粒骨架在酵母细胞内完成同源重组。论文使用的Cas9-sgRNA质粒带有KanMX标记，赋予酵母G418抗性，同时该质粒在大肠杆菌中以卡那霉素抗性筛选。guide序列通过PCR嵌入质粒，转化大肠杆菌后涂布含卡那霉素的LB平板，挑取克隆进行测序验证，确认guide正确插入。
酵母转化采用LiAc/PEG共转化法。 将验证过的Cas9-sgRNA质粒与HDR供体DNA同时转化酵母感受态细胞。转化体系基于醋酸锂和聚乙二醇，具体操作参数（如LiAc浓度、PEG分子量与浓度、热激温度与时间）论文摘要未详述。转化后细胞在YPD培养基中恢复培养，随后涂布YPD + G418平板，30°C培养2–3天。
编辑验证通过菌落PCR完成。 挑取6–8个克隆，用跨越同源臂的引物进行菌落PCR。正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增产物；缺失或插入突变会相对未编辑对照出现条带位移；点突变则需要DNA测序确认。论文强调，测序应覆盖编辑连接区域，并确认供体中设计的沉默PAM突变已正确引入。
质粒丢失检测在非选择培养基上进行。 编辑完成后，将克隆在无G418的YPD培养基中传代培养，使部分细胞自然丢失KanMX标记的Cas9质粒。随后通过影印接种到YPD和YPD + G418平板上，能在YPD上生长但不能在含G418平板上生长的克隆即视为已丢失质粒的“治愈”克隆。
研究结果
转化筛选的“多vs少”对比是第一步读值。 在YPD + G418平板上，30°C培养2–3天后，“CRISPR + HDR供体”条件通常产生大量菌落，而“无修复供体（–HDR donor）”对照组菌落极少。论文对这一现象的解释很直接：Cas9切割是致死性的，如果缺乏修复模板，细胞无法完成DNA修复就会死亡。因此，实验组和对照组菌落数量的悬殊对比，同时验证了两件事——转化和筛选体系工作正常，以及所选guide能在目标位点高效切割。
编辑验证的预期结果分层次呈现。 筛选6–8个菌落进行菌落PCR时，正确编辑的克隆应产生预期大小的扩增条带。对于缺失或插入突变，条带相对未编辑对照会有明显位移；点突变则需测序确认。论文给出的预期是：成功实验中，至少有一部分筛选菌落PCR呈阳性，且跨编辑连接区的DNA测序结果应确认设计基因型，包括供体中引入的沉默PAM破坏突变。
质粒丢失是可预期的自然过程。 在非选择培养基YPD中传代后，部分编辑克隆会丢失KanMX标记的Cas9质粒。通过影印接种到YPD和YPD + G418平板，可以清晰区分：治愈克隆在YPD上生长但在G418平板上不生长。这一步骤的价值在于为后续实验清除Cas9表达背景，避免残留的Cas9活性引发脱靶切割或不必要的基因组不稳定。
讨论与展望
这套协议最直接的收益是实验周期缩短。传统guide克隆需要酶切、连接、转化、挑菌、测序，至少2–3天；PCR引导插入把流程压缩到1天之内完成质粒构建。对于需要并行测试多个guide位点的筛选实验，这种效率提升是实质性的。
另一个值得注意的设计选择是使用KanMX/G418筛选标记。相比常用的URA3或LEU2营养缺陷标记，G418抗性不依赖特定营养缺陷菌株，适用面更广。论文在质粒丢失环节利用非选择培养基自然丢失质粒的策略，也避免了额外使用反向筛选标记（如URA3的5-FOA筛选）的麻烦——虽然5-FOA筛选更高效，但自然丢失在操作上更省事，且不引入额外试剂。
局限同样明显。论文摘要未提供具体编辑效率数值，也未给出guide设计规则之外的详细优化参数。对于编辑效率较低的位点，可能需要额外的guide筛选或供体优化。此外，PCR引导插入依赖酵母体内同源重组，guide序列本身的长度和GC含量可能影响重组效率，这一点在扩展应用到其他酵母种类时尤其需要留意。
这套方法的适用范围不止于酿酒酵母。任何具备高效同源重组能力的真菌——比如毕赤酵母或一些丝状真菌——理论上都可以沿用同样的策略。论文没有讨论这些扩展场景，但从方法学逻辑看，核心的“PCR引导插入+体内重组环化”思路具备天然的移植性。
参考来源
Rostamian H, Madden EW, Kaplan FM, Kim RS, Isom DG. Protocol for CRISPR genome editing in S. cerevisiae using PCR-based guide insertion. STAR Protoc. 2025. PMID: 42519825.
PMID: 42519825