来源：Nat Commun | 编译：DNA Lab Space
导读
自然界通过酶在微区室中的有序组织实现高效生物合成，但多酶级联在实际工业应用中常受限于酶不相容性、底物传质差和催化剂回收难等问题。本文报道了一种在Pickering乳液中运行的活体生物催化平台——通过可调超分子化学将油基光催化剂接枝到过表达酶的工程大肠杆菌表面，形成两亲性“超细菌”，自组装于水-油界面稳定乳液。该平台将化学催化与生物催化整合，实现高达45倍的反应速率提升，并支持单步、序贯及一锅法级联反应，包括克级苯偶姻合成。
研究背景
自然界中的酶级联系统堪称化学制造的巅峰，能将简单前体转化为复杂高价值分子，其精妙之处在于将多种酶组织在特定细胞微环境中，克服底物扩散、竞争反应和催化剂降解等难题。全细胞生物催化利用工程微生物作为自包含、自复制的微型工厂，避免了昂贵的酶纯化步骤，并原位提供辅助因子，颇具吸引力。然而，全细胞生物催化在多步级联反应中面临显著障碍：水相细胞环境与不混溶有机相之间的传质效率低下，导致反应速率缓慢；许多级联需要生物催化剂与化学催化剂的协同（化学酶法反应），而两者往往在不相容的条件下运行；有机溶剂的直接接触还会损害细胞活力。本研究旨在通过构建基于活细胞的Pickering乳液平台，解决上述瓶颈问题。
研究方法
材料
商业化学品未经进一步纯化直接使用。大肠杆菌（BL21(DE3)）菌株购自Thermo Fisher Scientific公司。细胞培养和酶表达的具体方法见补充信息。
油基催化剂（OBC）的合成
ⅰ）油基催化剂PFA的合成：首先，将棕榈油（88.5 g，0.1 mol）倒入烧瓶中，置于100 °C油浴中脱气1小时。随后，冷却至60 °C后，通过注射器加入2-（甲基氨基）乙醇（30.4 g，0.4 mol）和甲醇钠（0.6 mL，3 mmol）。反应密封过夜。12小时后，额外加入甲醇钠（0.6 mL，3 mmol），继续反应6小时。粗产物冷却至室温，用二氯甲烷（DCM）稀释。用饱和氯化钠溶液洗涤，直至有机相澄清。有机相用硫酸镁干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到纯PFA。
ⅱ）油基催化剂OBC的合成：将PFA（1.5 g，4.4 mmol）、蒽醌-2-羧酸（1.0 g，4 mmol）和4-（二甲氨基）吡啶（DMAP，0.5 g，4.4 mmol）溶解于20 mL DCM中。待完全溶解后，在冰浴中逐滴加入N，N'-二环己基碳二亚胺（DCC，0.9 g，4.4 mmol），反应过夜。产物过滤后，旋转蒸发除去溶剂，粗产物（有机相）经柱色谱纯化（乙酸乙酯：石油醚 = 1：3）。纯产物（OBC）为淡黄色固体。
氨基化CD（ACD）的合成
第一步：将β-环糊精（β-CD，25.0 g，22.0 mmol）溶解于250 mL 0.4 M氢氧化钠溶液中，在冰浴中冷却至5 °C以下。随后，在剧烈搅拌下于5分钟内逐渐加入对甲苯磺酰氯（17.5 g，92 mmol）。反应混合物在5 °C下持续搅拌30分钟，然后过滤。所得滤液用浓盐酸中和，继续搅拌1小时。过滤收集所得沉淀，用水充分洗涤（三次），60 °C干燥过夜，得到7.1 g白色固体，即OTs-CD。
第二步：将4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺（3.4 g，15.4 mmol）和OTs-CD（4.0 g，3.1 mmol）溶解于10 mL无水N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）中，然后加入碘化钾（KI，50 mg，0.3 mmol）。反应混合物在惰性无水气氛下于70 °C搅拌过夜。反应完成后，将所得黄色溶液冷却至室温，用200 mL乙醇稀释。过滤收集形成的沉淀，依次用乙醇和乙醚洗涤，并经柱色谱进一步纯化（乙腈：H₂O：氨水 = 1：1：0.2）。最后，纯化产物在50 °C下真空干燥过夜，得到2.6 g白色固体，即氨基化CD（ACD）。
偶联物（cell@OBC）的制备
ⅰ）偶联物（cell@CD）的制备：将新鲜收集的大肠杆菌分散于40 mL磷酸钾缓冲液（KPI缓冲液，pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。将ACD（10 mM）、EDC（18 mM）和NHS（14 mM）一起加入大肠杆菌分散液中，在4 °C下反应12小时，得到粗产物。反应结束后，用KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤三次，去除过量游离ACD和未反应试剂。离心收集产物，将最终偶联物（cell@CD）悬浮于KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0，备用。
ⅱ）偶联物（cell@OBC）的制备：将收集的cell@CD分散于40 mL KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）中，最终OD600为2.0。随后，将溶解于4 mL DMSO中的OBC（10 mM）加入上述缓冲液中，在4 °C下反应过夜。反应结束后，用含10% DMSO的KPI缓冲液（pH 8.0，0.1 M）洗涤3次，去除过量游离OBC。离心收集产物（cell@OBC）。
不同大肠杆菌的界面催化
将0.6 mL过表达不同酶的cell@OBC溶液与0.4 mL有机溶液混合，通过手摇制备乳液。然后，在乳液中加入100 mM底物以启动反应。在每个时间间隔，取20 μL混合物，用180 μL乙酸乙酯萃取，然后用无水硫酸镁干燥。离心后，取150 μL上清液用于气相色谱测量。所有实验均进行三次重复。
报告摘要
研究设计的更多信息见Nature Portfolio Reporting Summary。
研究结果
活体两亲性生物催化剂的设计与合成
研究从关键组件的模块化合成开始：氨基化β-环糊精（ACD）主体和定制OBC客体（补充图1）。两种分子的成功合成和纯度经¹H NMR、TLC-MS和FTIR光谱严格确认（补充图2、3、4和5）。在此基础上，对活体大肠杆菌BL21（DE3）细胞表面进行工程化改造。“超细菌”颗粒的构建是在温和、生物相容条件下执行的两步过程。第一步，通过偶联剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将ACD主体共价接枝到细胞表面，得到cell@CD偶联物（补充图6）。第二步，引入OBC客体，通过环糊精空腔内的主客体包合自发组装到细胞表面，形成最终的cell@OBC颗粒。UV-Vis光谱证实了OBC的成功非共价附着——cell@OBC在330 nm处显示蒽醌部分的特征吸收，而天然细胞与游离OBC的对照混合物中无此峰（补充图7），为稳定的超分子连接提供了明确证据。关键的是，研究验证了蒽醌单元的光催化活性未因其共轭到OBC结构中而受阻（补充图8）。
为可视化表面修饰并优化其密度，研究使用金刚烷标记的荧光素染料（AM-FITC）对cell@CD偶联物进行荧光标记，该染料特异性结合表面接枝的环糊精空腔（图2a）。设计的核心原则是在保持细胞活力和功能的同时调节表面化学。通过改变偶联试剂（EDC/NHS）浓度，可精确控制细胞表面β-CD的密度，通过相应的荧光强度增加进行定量（图2b）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示cell@CD偶联物周围有清晰的绿色荧光，而天然细胞或仅与染料混合的对照细胞无此现象，证实了β-CD主体的成功共价附着（图2c）。此外，修饰细胞与天然细胞之间的失重差异单调增加，揭示了表面接枝的可调性（图2d和补充图9）。随后表征ζ电位以评估表面电荷，显示随着超分子负载量的增加，从天然细胞的−45 mV逐渐移至−6 mV（图2e和补充图10）。这些发现表明，细胞表面的超分子层可被精确调控，以适应多样化的功能需求。
然而，这种功能化揭示了表面修饰程度与胞内酶活性保留之间的反比关系。研究使用过表达苯甲醛裂解酶（BAL）的大肠杆菌评估了对胞内酶功能的影响，发现过度表面功能化虽然增加了疏水性，但显著降低了酶的保留活性（图2f）。这一下降可能归因于致密表面层造成的传质限制或潜在的化学应激。相反，功能化不足则无法提供稳定乳液所需的足够两亲性（图2f，插图）。通过系统优化，研究确定18 mM EDC和14 mM NHS的偶联条件达到最佳平衡，在保持超过97%胞内酶活性的同时赋予稳健的乳化性能。为进一步确认超分子层附着于细胞表面不会引入额外的传质屏障，研究裂解cell@OBC释放游离BAL酶，将其活性与cell@OBC和天然细胞进行比较。结果显示三者之间几乎没有差异（图2g和补充图11），有力支持了这一假设。
增强的细胞稳健性与生物相容性
全细胞催化的一个关键优势在于细胞为酶提供的保护环境。研究假设表面修饰能进一步保护细胞免受过程中常见严苛条件的影响。为此，对cell@OBC偶联物施加热和化学应激。当暴露于45 °C两小时时，cell@OBC保留了初始胞内BAL活性的69.6%，比未修饰的天然细胞提高了2.4倍（图3a）。更引人注目的是，在甲苯-水界面（以诱导细胞裂解著称的条件）挑战下，cell@OBC偶联物在两小时后仍保持52.2%的活性，而天然细胞活性显著下降，稳定性提升了2.8倍（图3b）。研究还测试了N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO）等其他溶剂，进一步巩固了聚合物对有机溶剂的保护作用（补充图12）。此外，经2小时UV照射后，cell@OBC的保留活性比天然细胞高2.1倍（图3c和补充图13）。这些发现通过活/死染色测定得到佐证，可视化显示了cell@OBC偶联物在热和有机溶剂应激下相比天然对应物的优越活力（图3d-i）。
（待续：结果部分后半段——乳液性能表征、界面催化活性、级联催化与回收策略等，见原文Results and discussion后续章节）
讨论与解读
本研究通过精巧的超分子表面化学设计，成功构建了基于活细胞的Pickering乳液催化平台。该平台的核心创新在于：利用环糊精-客体超分子相互作用，将光催化剂可逆地锚定于细胞表面，既赋予细胞两亲性以稳定乳液，又保留了胞内酶活性（>97%）。界面处的“超细菌”显著加速了化学酶法和多酶级联反应，反应速率较传统双相体系提升高达45倍。更重要的是，动态超分子连接使按需双模式回收成为可能——活细胞偶联物可重复使用，或选择性回收合成催化剂并重新附着到新鲜细胞上。5 L放大实验和约7.5 g纯苯偶姻的获得初步展示了规模化应用潜力。
编译者解读：该研究代表了合成生物学与胶体界面科学的交叉创新。将化学催化剂“穿戴”于活细胞表面而非封装于胞内，巧妙规避了化学催化剂与生物催化剂的相容性问题，同时通过Pickering乳液大幅增加了有效反应界面面积。双模式回收策略直击工业生物催化中催化剂成本高的痛点。不过，当前平台仍依赖手摇乳化，放大过程的均质化控制、长期运行稳定性及更多工业级底物的适配性尚待验证。未来若能与无细胞系统或固定化酶技术形成互补，有望在绿色合成领域开辟更广阔的应用空间。
参考来源
Wu X, Dimde M, Karring H, Wang Z, Wu C. Assembly-Line Biosynthesis in Living-Cell Emulsions via Tunable Supramolecular Surface Chemistry. Nat Commun. PMID: 42342679.
PMID: 42342679