来源：Front Microbiol | 编译：DNA Lab Space
一杯未经巴氏杀菌的生牛奶，可能暗藏一种致命威胁——单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）。这种病原体对孕妇、老年人和免疫力低下人群尤其危险，传统检测往往依赖培养增菌或核酸扩增，耗时数天且需要专业设备。2025年发表在《Frontiers in Microbiology》上的一项研究，尝试用合成生物学中的“脚趾开关”（toehold switch）传感器，在无细胞体系中直接识别生牛奶中的李斯特菌RNA。论文通讯作者来自墨西哥的José E. Barboza-Corona团队，他们证明：不经过NASBA等核酸扩增步骤，脚趾开关也能被复杂食品基质中的细菌RNA激活。这是该技术首次在生牛奶这类真实食品体系中实现对食源性病原体的直接检测。
研究背景
脚趾开关是合成生物学中一类经典的RNA传感器。它由一段经过设计的信使RNA（mRNA）构成，其5‘端非翻译区含有一个被“锁住”的核糖体结合位点（RBS）。当特定的触发RNA（trigger RNA）与开关的脚趾区域互补结合后，结构解锁，核糖体得以结合并翻译下游的报告基因（如GFP或lacZ）。这种传感器此前已在多种场景中验证过，但绝大多数工作使用的是人工合成的短RNA触发子，且反应体系为纯化的缓冲液。真正把脚趾开关扔进生牛奶这种富含脂肪、蛋白、核酸酶和背景菌群的复杂基质里，让它直接识别目标病原体的RNA——这项研究之前，还没有人做过。
李斯特菌属的16S rRNA基因包含高变区V2-V3，这段序列在不同细菌类群之间差异显著。研究者看中的正是这一点：如果能设计出只匹配李斯特菌V2区序列的脚趾开关，理论上就能在混合RNA背景下特异性识别目标菌。但生牛奶中的RNA提取物成分复杂，非靶标RNA的干扰、核酸酶的降解、以及基质本身对无细胞表达系统的抑制，都是现实障碍。这项研究要回答的核心问题是：脚趾开关的灵敏度，能否从皮摩尔级的合成RNA，延伸到真实牛奶样品中的细菌总RNA？
研究方法
靶标筛选与系统发育分析。 研究者首先从公共数据库获取了110条细菌16S rRNA基因的V2-V3高变区序列，涵盖李斯特菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌等与乳制品相关的类群。用最大似然法构建系统发育树，评估李斯特菌属是否形成独立且支持度高的单系分支。基于序列比对，他们在V2区域锁定了一段36个核苷酸（nt）的触发序列，该序列与李斯特菌属完全匹配，而非李斯特菌的细菌则存在多个错配位点。这一步骤为后续脚趾开关的设计提供了序列基础。
脚趾开关设计与构建。 针对李斯特菌V2区的36-nt触发序列，研究者设计并构建了三个不同的脚趾开关变体，命名为A、B、C。每个开关均包含与触发序列互补的脚趾区域、茎环结构以及报告基因。三者的差异在于脚趾区域的序列组成和茎环的热力学稳定性。通过体外转录合成各开关的mRNA，并在无细胞表达系统中测试其基础表达水平和触发响应能力。筛选标准是“实验稳定性”——即在无触发子存在时，开关的背景表达应尽可能低；加入触发子后，报告基因表达应显著上升。经过三轮重复实验，开关B表现出最高的稳定性，被选为后续实验的唯一传感器。
无细胞表达系统与触发响应测试。 无细胞反应体系采用商品化的大肠杆菌裂解物（如NEB PURExpress或类似系统），反应体积为10-20 μL，在37°C下孵育30分钟。报告基因选用荧光蛋白，通过酶标仪测量荧光强度。为评估开关的动态范围，研究者合成了与V2区36-nt触发序列完全一致的RNA触发子，以10倍梯度稀释，覆盖从10到10^12个RNA拷贝（对应浓度50 aM至5 μM）。每个浓度点设三个重复，记录30分钟时的荧光值，计算相对于无触发子对照的倍数变化（fold change）。
细菌RNA提取与传感器激活。 纯培养实验：将李斯特菌在BHI培养基中培养至对数期，分别用两种方法提取总RNA——基于柱式提取试剂盒（如Qiagen RNeasy）和基于TRIzol的有机相萃取法。提取的RNA用分光光度计定量，测量OD260/280比值和OD600处的吸光度（用于评估纯度）。牛奶实验：将李斯特菌接种到未经巴氏消毒的生牛奶中，混匀后直接用TRIzol法提取总RNA。同时设置未污染的生牛奶作为阴性对照。提取的RNA（浓度未在摘要中详述）作为触发子加入无细胞反应体系，与脚趾开关B共孵育30分钟，测量荧光激活倍数。每个实验组至少三个生物学重复，数据以平均值±标准差表示，用t检验或方差分析比较组间差异。
数据统计与判定标准。 激活倍数（fold change）定义为加入触发RNA后的荧光强度除以无触发子对照的荧光强度。若激活倍数大于1且与阴性对照差异具有统计学意义（p<0.05），则判定为阳性响应。研究者还比较了不同RNA提取方法对激活效率的影响，以及纯培养RNA与牛奶基质RNA在激活效果上的差异。
研究结果
系统发育分析确认V2-V3区的属间特异性。 基于110条序列构建的最大似然树显示，所有李斯特菌属菌株聚为一个单系分支，分支内部短且支持度高（SH-like aLRT值0.75-1.0），表明该属内V2-V3区序列差异极小。非李斯特菌类群（芽孢杆菌科、乳杆菌目、放线菌、肠杆菌目、假单胞菌目）各自形成独立分支，且分支长度明显长于李斯特菌属，反映出跨类群的序列分歧。没有任何非李斯特菌序列靠近李斯特菌分支——这为V2-V3区作为李斯特菌属特异性分子靶标提供了系统发育学证据。
脚趾开关B的体外响应曲线。 在没有NASBA扩增的条件下，脚趾开关B对合成RNA触发子的响应呈现典型的剂量依赖关系。当触发子拷贝数为10^12（对应5 μM）时，30分钟内荧光信号达到最大，激活倍数为17倍；10^11拷贝（500 nM）时激活倍数为5倍。随着拷贝数降低，激活倍数逐步下降，但在10拷贝（50 aM）的极低输入下仍可检测到高于背景的信号。基于这些数据，研究者选择了一个工作浓度用于后续生物RNA实验——摘要未明确该浓度的具体数值，但指出该浓度下传感器既能被有效激活，又不会因过量触发子导致非特异性响应。
纯培养李斯特菌RNA的激活效果。 用柱式试剂盒或TRIzol法提取的李斯特菌RNA，在OD600处均达到最大吸光度3.5，说明两种方法提取的RNA产量和纯度相当。将纯培养的李斯特菌RNA加入无细胞体系后，脚趾开关B的激活倍数为1.8。这一数值远低于合成RNA触发子（17倍），但显著高于无触发子的背景对照。
生牛奶基质中的直接检测。 从人工污染了李斯特菌的生牛奶中提取RNA，脚趾开关B的激活倍数为约1.5。而从未污染的生牛奶中提取的RNA，激活倍数仅为0.73——不仅没有激活，反而略低于背景。统计学检验显示，污染牛奶组的激活倍数（1.5）与未污染组（0.73）差异显著（p<0.05），证明传感器确实响应了牛奶中的李斯特菌RNA，而非牛奶基质本身的非特异性干扰。研究者指出，虽然1.5倍的激活倍数在数值上不高，但这是在无核酸扩增、无细胞体系、复杂食品基质的条件下实现的——此前从未有报道做到这一点。
方法学对比与实验稳定性。 TRIzol法提取的RNA在无细胞测定中产生的结果与柱式试剂盒一致，说明两种提取方案均可用于该检测流程。研究者特别强调，所有激活实验均未使用NASBA或其他核酸扩增手段，传感器直接识别的是细菌总RNA中的靶标序列。
讨论与展望
这项研究的意义在于跨越了一道门槛：脚趾开关不再只是试管里的“玩具”，而是能在生牛奶这种真实食品基质中识别病原体RNA的功能性传感器。1.5倍的激活倍数确实不高，但在无扩增条件下，面对牛奶中大量非靶标RNA和抑制因子的干扰，这个信号已经足以与阴性对照（0.73）区分开。研究者选择V2-V3高变区而非保守区作为靶标，策略上牺牲了部分通用性，换来了对李斯特菌属的特异性——系统发育树中该区域跨属的显著分歧，为这一选择提供了依据。
从应用角度看，该技术距离实用化还有明显距离。1.5倍的激活信号在便携式设备上可能难以稳定判读，且当前仍依赖实验室级的RNA提取和无细胞表达系统。但论文的贡献在于概念验证——它证明了无需扩增、无需活菌培养，直接检测食品基质中的病原体RNA是可行的。未来若能将RNA提取简化为一步裂解、将报告基因换成肉眼可见的比色信号，这类传感器有望成为低成本、可部署于资源有限地区的食品安全筛查工具。论文通讯作者Barboza-Corona团队长期从事李斯特菌检测技术开发，这项工作是他们在合成生物学与食品安全的交叉领域的一次尝试。
参考来源： Carballo-Uicab VM, Casados-Vázquez LE, Endy D, Barboza-Corona JE. Synthetic toehold biosensors for detecting Listeria monocytogenes in raw milk. Frontiers in Microbiology, 2025. PMID: 42568536.
PMID: 42568536