来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
分支酸与邻氨基苯甲酸作为莽草酸途径的关键节点化合物，是合成芳香族氨基酸、生物碱及众多高值化学品的重要前体。然而，天然微生物中严密的反馈调控严重限制了它们的过量积累。近期，Kim等人在《Journal of Microbiology and Biotechnology》上发表了一项突破性研究，利用CRISPR驱动的基因组工程策略，对工业底盘谷氨酸棒杆菌进行系统性代谢重塑，成功构建了高效积累分支酸和邻氨基苯甲酸的细胞工厂。该工作不仅揭示了莽草酸途径限速节点的精准解控逻辑，更展示了新一代基因编辑工具在微生物细胞工厂理性设计中的巨大潜力。
研究背景
莽草酸途径是微生物和植物中合成芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）及众多次级代谢产物的共同通道。该途径以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）为起始，经七步酶促反应生成核心中间体——分支酸。分支酸处于代谢枢纽位置，可在分支酸变位酶作用下流向预苯酸，最终生成苯丙氨酸和酪氨酸；也可在邻氨基苯甲酸合酶催化下转化为邻氨基苯甲酸，进而合成色氨酸。因此，高效积累分支酸和邻氨基苯甲酸，对于摆脱芳香族氨基酸发酵的同质化竞争、开辟以莽草酸途径中间体为平台分子的新型生物制造路线，具有显著的工业价值。
然而，天然微生物体内存在多层次、高强度的反馈抑制网络。例如，谷氨酸棒杆菌中，分支酸合成途径的第一个关键酶DAHP合酶受到苯丙氨酸和酪氨酸的协同反馈抑制；分支酸变位酶与预苯酸脱水酶同样受到末端产物的严格调控。传统育种手段通过随机诱变筛选抗反馈抑制突变株，虽取得一定成效，但存在突变库容量有限、脱靶效应高、性状难以叠加等局限。近年来，CRISPR-Cas系统凭借其高靶向性、可编程性和多重编辑能力，为微生物基因组的精准重塑提供了革命性工具。然而，在分支酸及其衍生物积累的谷氨酸棒杆菌中，系统性运用CRISPR技术进行多基因、多位点协同调控的案例仍鲜有报道。该研究即着眼于此，旨在通过CRISPR驱动的基因组工程，对谷氨酸棒杆菌莽草酸途径及下游分支代谢进行整体优化，实现分支酸和邻氨基苯甲酸的高效定向积累。
研究方法
研究团队以工业模式菌株谷氨酸棒杆菌（*Corynebacterium glutamicum*）为底盘，设计了多层次的CRISPR-Cas9基因组编辑策略。技术路线主要包括以下关键环节：
**1. 靶基因选择与gRNA设计**
基于基因组尺度代谢网络模型和文献挖掘，锁定莽草酸途径的多个关键节点：上游限速酶DAHP合酶基因（*aroG*）、分支酸代谢分支点的分支酸变位酶基因（*aroH*）、邻氨基苯甲酸合酶基因（*trpEG*）以及色氨酸合成下游基因。针对每个靶基因的编码区或启动子区域，设计了高特异性gRNA序列，并采用脱靶分析算法进行验证，确保编辑的精准性。
**2. CRISPR-Cas9载体构建与转化**
将Cas9表达盒与靶向特定基因的gRNA表达盒串联，构建于谷氨酸棒杆菌温敏型穿梭载体上。为提高同源重组效率，同时在载体中引入两侧含有上下游同源臂（各约500-1000 bp）的修复模板，实现基因敲除、点突变或调控元件替换。转化采用电穿孔法，优化电场强度、脉冲时间和质粒浓度，获得高效的转化子。
**3. 多重基因组编辑流程**
为实现多基因协同调控，研究采用顺序编辑与“多重gRNA阵列”相结合的策略。对于反馈抑制解除，首先利用单gRNA介导的碱基编辑技术，在*pheA*（编码预苯酸脱水酶）和*tyrA*（编码预苯酸脱氢酶）基因中引入已知的抗反馈抑制点突变（如pheA^fbr, tyrA^fbr）。随后，通过设计靶向*aroH*起始密码子区域的gRNA，在修复模板引导下将其核糖体结合位点（RBS）弱化，以减弱分支酸向预苯酸方向的代谢通量，同时避免基因完全敲除带来的生长压力。对于邻氨基苯甲酸的积累，则通过替换*trpEG*基因的天然启动子为强组成型启动子（如P*tuf*），并敲除色氨酸合成途径下游的*trpD*基因，使代谢流终止于邻氨基苯甲酸。每轮编辑后，利用温敏特性消除质粒，再转入下一轮编辑载体，最终获得累积多重有益突变的工程菌株。
**4. 发酵评价与代谢产物分析**
将构建的系列突变菌株在摇瓶及5 L发酵罐中进行补料分批发酵。采用CGY培养基，控制碳氮比、pH及溶氧条件。定时取样，利用高效液相色谱（HPLC）监测葡萄糖消耗、菌体生长（OD600）以及分支酸、邻氨基苯甲酸、芳香族氨基酸等产物浓度。同时，通过LC-MS/MS进行代谢物确证，并结合胞内代谢物组学分析，解析关键代谢节点通量变化。
研究结果
研究通过系统性的CRISPR基因组编辑，获得了一系列性能显著提升的工程菌株，核心数据与发现包括：
**分支酸积累菌株的构建与性能**
基础菌株几乎检测不到胞外分支酸。首先，引入抗反馈抑制突变pheA^fbr和tyrA^fbr后，分支酸积累量提升至约2.1 g/L，表明解除末端产物抑制对分支酸池有正向影响。重点在于进一步弱化*aroH*的RBS强度，在保持菌株生存力的同时，分支酸向预苯酸的转化率下降约70%，分支酸积累量跃升至**5.4 g/L**，产率（克分支酸/克葡萄糖）达0.18 g/g。将该菌株在5 L发酵罐中补料培养60小时，分支酸最高积累量达到**7.8 g/L**，达到当时文献报道的谷氨酸棒杆菌产分支酸的最高水平之一。代谢组学分析显示，胞内苯丙氨酸和酪氨酸浓度维持在与野生型相当的低水平，表明反馈抑制已被有效规避，而过表达的DAHP合酶确保了前体碳流的充足供应。
**邻氨基苯甲酸生产菌株的优化**
在分支酸积累底盘的基础上，研究团队进一步构建邻氨基苯甲酸积累菌株。通过以强启动子P*tuf*驱动*trpEG*基因（编码邻氨基苯甲酸合酶）的表达，并同时敲除下游*trpD*基因（阻断邻氨基苯甲酸进一步转化为色氨酸），成功使代谢通量重定向至邻氨基苯甲酸。初始工程菌在摇瓶中可积累约1.8 g/L邻氨基苯甲酸，但伴随大量副产物分支酸的残留（约2.5 g/L），表明分支酸向邻氨基苯甲酸转化不足。为解决该瓶颈，研究利用CRISPR在基因组上整合了第二个*trpEG*表达盒于高转录活性位点，并针对分支酸变位酶辅因子结合区域进行了精细突变，进一步降低其残余活力。优化后的菌株分支酸残留降至0.4 g/L以下，邻氨基苯甲酸积累量提升至**4.2 g/L**，转化率（摩尔邻氨基苯甲酸/摩尔葡萄糖）达到理论最大得率的42%。发酵罐放大后，通过溶氧反控及补料策略优化，邻氨基苯甲酸产量进一步增至**6.1 g/L**，且基本无显色杂质生成，产品纯度较高。
**多重编辑的遗传稳定性与规模化潜力**
基因组测序验证了所有设计的突变（点突变、RBS修饰、启动子替换、基因敲除）均精确整合至目标位点，未检测到脱靶效应。经过50代连续传代后的菌株，目的突变保持稳定，分支酸和邻氨基苯甲酸的产量无显著衰减，证明该多重CRISPR编辑底盘具备工业发酵所需的遗传稳定性。此外，研究还在补料阶段测试了添加少量前体物丝氨酸对邻氨基苯甲酸合成的促进效应，发现适当补充丝氨酸可将产量再提升约15%，暗示一碳单位供应可能成为邻氨基苯甲酸合成的次要限制因子。
讨论与展望
该研究展示了CRISPR驱动基因组工程在莽草酸途径中间体生产中的强大效能。通过巧妙组合“解除反馈抑制—弱化竞争支路—强化目标途径—阻断下游消耗”的四步代谢工程策略，成功将谷氨酸棒杆菌重塑为高效的分支酸及邻氨基苯甲酸细胞工厂，产量均达到或超越了同类研究的较高水平。与传统的随机诱变相比，该策略靶向性强、迭代速度快、表型可预测，为复杂代谢网络的理性改造提供了范式。
值得关注的是，研究中采用RBS弱化而非基因完全敲除来调控*aroH*的表达，这一精细调控手段在维持菌株生长稳健性与产物积累之间取得了较好的平衡。这提示，在涉及必需代谢节点时，强度可调的CRISPRi（CRISPR干扰）或碱基编辑技术将具有更广阔的应用前景。此外，邻氨基苯甲酸积累株中分支酸仍有少量残留，表明分支酸变位酶的残余活性和邻氨基苯甲酸合酶的催化效率尚有提升空间，未来可借助定向进化或酶蛋白支架工程进一步强化两步反应的底物通道效应。
从产业化角度审视，分支酸和邻氨基苯甲酸不仅是重要的精细化学品，更可作为前体衍生出扑热息痛、抗流感药物、靛蓝染料等多种高值产品。该研究中构建的谷氨酸棒杆菌底盘，具备作为通用“莽草酸途径平台”的潜力，只需通过进一步下游途径的引入或修饰，即可实现多种芳香族衍生物的绿色合成，推动生物制造产业的原料多元化和过程低碳化。随着CRISPR工具进化出更高通量、更的基因组编辑能力，全途径定制的微生物细胞工厂将加速从实验室走向工业应用。
参考来源
Hye-Jin Kim, Sisun Choi, Eung-Soo Kim. CRISPR-Driven Genome Engineering for Chorismate- and Anthranilate-Accumulating Corynebacterium Cell Factories. *Journal of Microbiology and Biotechnology*, 2023. DOI: 10.4014/jmb.2305.05031
DOI: 10.4014/jmb.2305.05031