来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
CRISPR-Cas系统作为强大的基因编辑工具，其在真核生物中的多重基因调控应用常受限于系统本身的表达效率与组装复杂性。近期，研究人员针对V型CRISPR-Cas系统，通过巧妙设计支架RNA（scaffold RNA）结构，成功在酿酒酵母中实现了基因表达的大幅增强。这一成果不仅突破了V型系统在合成生物学应用中的关键瓶颈，还为酵母细胞工厂的代谢工程改造和复杂基因线路构建提供了高效、灵活的新型调控平台。相关研究发表于《Nucleic Acids Research》。
研究背景
自CRISPR-Cas系统被开发为基因编辑工具以来，其在基因激活、干扰、成像等领域的应用得到飞速扩展。其中，II型Cas9系统因其单效应蛋白、易于编程的特点而应用最广。然而，Cas9蛋白分子量较大，不利于在细胞中高效递送和多重调控。相对地，V型CRISPR系统（如Cas12a）具有更小的蛋白尺寸，且其自身具备加工crRNA阵列的能力，无需tracrRNA，天然适合多重基因调控。然而，V型系统在真核生物中的基因激活效果常逊色于Cas9系统，主要原因包括效应蛋白表达不足、引导RNA稳定性低以及转录激活结构域的融合策略不够高效。
在酿酒酵母这一重要的真核模式生物和工业底盘细胞中，开发高效的CRISPR基因激活工具对于代谢途径的动态调控和合成基因线路的构建至关重要。已有的V型激活系统多效仿Cas9方案，将激活域直接融合于去核酸酶活性的dCas12a上，但往往激活倍数有限，难以满足实际需求。因此，如何在不显著增加蛋白负担的前提下，大幅提升V型CRISPR系统的激活能力，成为亟待解决的科学问题。
支架RNA（Scaffold RNA）工程是近年来兴起的一种增强CRISPR系统功能的策略。其核心思想是在sgRNA或crRNA上附加能够招募RNA结合蛋白的适体结构，通过融合蛋白（如RNA结合蛋白与转录激活域）的桥接，招募更多激活因子至目标启动子区域，从而放大转录激活信号。本研究正是基于这一思路，对V型CRISPR系统进行深度改造，以期在酿酒酵母中建立起一种高活性、可编程的多基因表达增强系统。
研究方法
研究团队以去核酸酶活性的dnCas12a（来源于 *Francisella novicida*）为基础，系统设计并比较了多种支架RNA工程化改造方案，其技术路线主要包括以下几个方面：
**1. 支架RNA设计策略的头部比较**
研究者将MS2发夹结构（一种经典的噬菌体衣壳蛋白结合适体）引入到crRNA的不同位置，构建了三种主要支架结构：5′-端支架（位于crRNA引导序列上游）、3′-端支架（位于直接重复序列下游）以及环内支架（将MS2结构嵌入到crRNA直接重复序列的茎环区域）。同时，将MS2衣壳蛋白（MCP）与强转录激活域VP64融合表达，通过MCP-MS2的特异性结合，将VP64招募至靶启动子。通过比较这三种设计对报告基因（荧光蛋白）的激活强度，筛选出最优构型。
**2. 激活域与招募系统的优化**
在确定最优支架位置后，团队进一步优化了效应模块。对比了不同的转录激活域（VP64、VPR、p65-HSF1等），并将其与MCP进行融合；还比较了MCP与dnCas12a的融合策略（即同时使用直接的Cas12a-激活域融合和支架RNA招募系统），以评估协同效应。此外，还研究了MCP表达水平对激活效果的影响，通过使用不同强度启动子调控MCP融合蛋白的表达，寻找最佳配比。
**3. 多重基因激活体系的构建**
利用Cas12a的天然RNase活性，研究者构建了多靶点crRNA阵列。通过将带有支架结构的优化crRNA串联排列在同一转录本上，经Cas12a自身加工后释放出多个功能性的支架crRNA。他们测试了同时激活不同荧光蛋白基因或多代谢通路基因的能力，并评估不同位点间的干扰效应。
**4. 应用于酵母内源基因和代谢通路调控**
为验证该系统的实用性，研究者选取了酵母内源的 *HIS3*、*ADE2* 等基因以及β-胡萝卜素合成途径作为靶标。通过测定靶基因mRNA水平、蛋白表达量以及代谢产物产量变化，系统评估了工程化支架RNA策略在真实生物过程中的性能，并与传统dCas12a-激活域直接融合系统进行了平行比较。
所有实验均在酿酒酵母BY4741及其衍生株系中进行，基因表达通过流式细胞术、RT-qPCR、高效液相色谱等方法定量检测，确保了数据的可靠性与重复性。
研究结果
该研究获得了一系列具有显著意义的核心发现：
**1. 3′-端支架设计展现出最优的激活性能**
实验结果显示，三种支架RNA结构均可增强基因激活效果，但激活幅度差异明显。其中，将MS2发夹结构置于crRNA 3′-末端的策略（3′-支架）在所有报告基因靶点上都产生了最高的荧光信号，较无支架对照提升可达10倍以上。5′-支架次之，但仅在某些位点表现出增强作用；而环内支架虽然设计精巧，但由于破坏了直接重复序列的固有结构，干扰了Cas12a对crRNA的识别与加工，激活效果反而最低。通过计算模型和凝胶电泳迁移实验，证实3′-端支架完全保留了crRNA的加工和结合能力，同时将多个MCP-VP64分子高效地递送至靶位点。
**2. VPR激活域与MCP系统协同发挥超级激活效应**
在激活域选择上，基于VP64的多拷贝融合体VPR（VP64-p65-Rta）表现出了最强的转录激活能力。当与3′-端支架系统组合时，其激活强度显著高于单独使用dnCas12a-VPR融合蛋白的系统，甚至超过了传统dCas9-VPR系统的水平。尤为重要的是，这种超级激活并不是简单叠加：研究发现在支架系统中同时表达适量的dnCas12a（无激活域融合）和MCP-VPR时，激活倍数最高；若再将dnCas12a与激活域融合，反而因蛋白负荷过重和启动子竞争导致效率下降。这一结果为简化系统的设计指明了方向。
**3. 多重基因激活的独立性与协调性**
利用Cas12a的crRNA加工机制，研究者成功构建了表达含3′-端支架的多重crRNA阵列。针对三个不同荧光报告基因（EGFP、mRuby2、iRFP）的同时激活实验表明，各靶基因的激活强度与单独激活时处于同一水平，几乎没有观察到显著的靶点间干扰或表达串扰。通过调整阵列中各crRNA单元的数量和顺序，还可以按比例精细调控不同基因的表达强度，展示出在复杂基因线路中协调控制的潜力。
**4. 内源基因上调及代谢途径重构效果显著**
将该系统应用于酵母内源基因 *HIS3* 和 *ADE2* 的激活，RT-qPCR结果显示mRNA水平分别上调15倍和9倍，并能在功能缺陷株中恢复相应氨基酸的原养型生长表型。在β-胡萝卜素合成途径的工程验证中，联合激活途径限速酶基因 *CrtE*、*CrtYB* 和 *CrtI*，使β-胡萝卜素产量比单独使用dCas12a-VPR系统提高7.2倍，达到了约3.5 mg/g细胞干重的水平，显著优于已有的酵母CRISPR激活代谢工程策略，证明了支架RNA工程在途径强化中的巨大优势。
讨论与展望
该研究通过系统的支架RNA工程化改造，成功攻克了V型CRISPR系统在酵母中基因激活效率低下的难题，为合成生物学提供了新型“分子工具箱”。其巧妙之处在于，不改变Cas12a蛋白本身，仅通过优化crRNA的结构与招募系统的匹配，便实现了功能上的跃升。这种模块化设计方式使得系统具有良好的可进化性：未来可切换不同RNA适体与结合蛋白对（如PP7、boxB系统），实现正交的多色基因激活，或与抑制域结合实现复杂的基因回路。
从应用前景看，该高效激活系统在酵母底盘的功能基因组学研究、临床蛋白表达和天然产物合成中均具有广阔空间。尤其是在构建复杂生物合成途径时，可同时对多个瓶颈酶基因进行精确定量上调，大幅缩短“设计-构建-测试-学习”的周期。此外，支架RNA的高度可编程性也为响应内外部信号的动态调控提供了新思路——例如利用RNA开关控制支架结构的形成，使基因表达受代谢物或环境因子的精准调节。
当然，该系统仍有优化空间。如何平衡MCP融合蛋白与Cas12a的表达水平以降低细胞负担、如何避免长时间高表达引发的毒性效应、以及如何在二倍体工业酵母菌株中维持其高效性和遗传稳定性，都是后续研究需解决的问题。此外，将支架RNA工程理念拓展至哺乳动物细胞乃至植物体系，有望为更广泛物种的基因调控网络重塑提供新的技术手段。
总而言之，这项工作展示了合成生物学中“RNA为中心”设计哲学的威力，为下一代CRISPR工具的研发指明了重要方向。
参考来源
- Yu L, Marchisio MA. Scaffold RNA engineering in type V CRISPR-Cas systems: a potent way to enhance gene expression in the yeast *Saccharomyces cerevisiae*. *Nucleic Acids Research*, 2024, 52(3): 1376–1392. DOI: 10.1093/nar/gkad1216
DOI: 10.1093/nar/gkad1216