来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
解脂耶氏酵母（*Yarrowia lipolytica*）凭借独特的疏水底物利用能力和旺盛的乙酰辅酶A代谢通量，已成为合成生物学的底盘明星。自2014年CRISPR/Cas9系统首次在该菌中成功建立以来，十年间基因组编辑工具不断迭代，从单基因敲除迈向多重基因组重编程与精准调控，极大推动了油脂化学品、有机酸、萜类化合物等的高效生物制造。Dias等近期发表的综述《10 years of CRISPR/CAS genomic engineering in *Yarrowia lipolytica*》系统梳理了该领域的技术演进、核心策略与应用里程碑，为理性设计和工业转化提供了全景视角。本文对该综述进行深度解读，以飨读者。
研究背景
*Y. lipolytica*是一种非常规产油酵母，具有高度分泌能力、宽底物谱和强大的乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A前体供应，常被称为“生物炼制的工厂”。然而，其早期遗传改造受限于同源重组效率低、缺乏稳定的游离型质粒、以及筛选标记有限等问题，使菌株开发周期漫长。2014年，CRISPR/Cas9异源表达在*Y. lipolytica*中首次实现RNA引导的基因组编辑，标志着该菌正式进入高效理性工程时代。十年间，CRISPR工具箱已从最初的SpCas9单一核酸酶扩展到Cas12a（Cpf1）、Cas13、切口酶（nCas9）、失活型Cas9（dCas9）融合功能域、碱基编辑器（BE）和先导编辑器（PE）等，编辑尺度从indel突变、精确点突变到大片段染色体整合和多重位点同步操作，调控层次也从基因敲除拓展至CRISPR干扰/激活（CRISPRi/a）等多维转录控制。然而，编辑效率受sgRNA活性、递送方式、PAM分布和修复途径等多种因素制约，不同实验室报道的编辑效率差异显著。该综述旨在对2014至2024年间CRISPR/Cas在*Y. lipolytica*中的工程化应用进行系统总结，分析技术瓶颈并展望未来发展方向。
研究方法
尽管该论文为综述性质，但作者团队采用了严谨的系统文献分析方法。检索范围覆盖PubMed、Scopus、Web of Science等数据库，时间跨度为2014年1月至2024年6月，关键词组合包括“*Yarrowia lipolytica* CRISPR”“genome editing”“Cas9”“Cas12a”“CRISPRi”“base editing”“multiplex”等。纳入标准为经同行评议的原创新究论文及重要预印本，排除仅提及但未提供实验数据的评述。最终筛选出120余篇核心文献，按照编辑工具类型（Cas9、Cas12a、dCas9、BE/PE）、应用层级（基于NHEJ的基因破坏、基于HDR的精确编辑、转录调控、多重编辑）和产物类别（脂质、类胡萝卜素、有机酸、重组蛋白等）进行分类归纳。同时，作者从每篇研究中提取关键参数——启动子选择（如*UAS1B8-TEF*、*EXP1*、*hp4d*）、sgRNA表达策略（RNA聚合酶II或III启动子，tRNA或核酶释放系统）、Cas蛋白密码子优化版本、递送方式（游离质粒、整合表达、RNP瞬时转化）、编辑效率计算方法以及基因型验证手段——构建多维分析表格，以此为基础绘制技术演进路线图，并比较不同策略的通量和适用场景。这一方法学框架保证了综述结论的系统性和可重现性。
研究结果
综述核心发现呈现为以下五个方面的技术跃迁和应用突破：
**1. Cas9系统的高效建立与优化**
最早在2014-2016年，研究人员利用人源优化SpCas9和sgRNA的游离表达，通过非同源末端连接(NHEJ)引入indel，在*ku70*缺陷株中达到80%以上的基因破坏效率。关键改进包括：(i) 采用RNA聚合酶II型复合启动子（如*TEF-intron*）驱动sgRNA，可免于5′帽化需求；(ii) 以tRNA侧翼序列加工释放多个sgRNA，实现多基因同步敲除；(iii) 共表达*LEU2*等营养缺陷标记与Cas9，结合瞬时质粒消除，实现无痕编辑。同源重组修复(HDR)介导的精确整合效率起初较低（10%~30%），但通过以下策略可显著改善——使用单链寡核苷酸供体（ssODN）、破坏NHEJ关键因子*ku70/80*、同步导入切割位点两侧同源臂（长度500~1000 bp）的线性DNA盒、以及细胞周期同步化处理，使点突变和大片段整合效率提升至70%~90%。
**2. Cas12a（Cpf1）扩展PAM空间**
由于SpCas9依赖5′-NGG-3′ PAM序列，限制了某些AT富集区域的可编辑性。2017年起，来源于*Francisella novicida*的FnCas12a和*Lachnospiraceae bacterium*的LbCas12a在*Y. lipolytica*中被成功应用，其PAM为5′-TTTV-3′，显著拓宽了基因组靶向窗口。Cas12a独有的RNA自我加工能力使其天然适合多重编辑——单一crRNA阵列由内源性RNase活性切割为多个成熟crRNA。综述数据显示，在*pex10*、*mfe1*等多基因敲除应用中，Cas12a的三重编辑效率可稳定在60%以上，且脱靶率低于Cas9。此外，Cas12a诱导的DNA黏性末端有利于通过微同源介导的修复进行精确缺失。
**3. 转录调控工具CRISPRi/a的精细化**
将核酸酶失活的dCas9或其融合抑制结构域（如Mxi1、Krüppel相关盒KRAB）与靶向启动子区的sgRNA结合，实现了基因转录的可逆沉默。在*Y. lipolytica*中，融合Mxi1结构域（源自一种转录抑制因子）的CRISPRi系统可将脂质合成竞争途径（如β-氧化基因*pox1-6*）的表达抑制**80%~95%**，使脂质滴积累显著增加。而dCas9-VP64（激活域）或基于SunTag系统的多重激活因子招募，可使沉默基因（如异源途径酶）的表达提升数倍至数十倍。综述特别指出，CRISPRi的这一高效性使得在该酵母中对必需基因的功能筛选成为可能，这是传统基因敲除难以实现的。
**4. 多重基因组操作与代谢途径组装**
将多个独立表达的sgRNA表达盒或tRNA-sgRNA多顺反子系统与Cas9/Cas12a协同，可同时编辑5~6个基因位点。例如，通过一轮转化同时敲除*pex10*、*mfE1*与整合β-胡萝卜素合成模块，构建了类胡萝卜素高产菌株。进一步，结合“粘贴”技术（如Cre-loxP无痕标记回收、整合酶系统）实现了多轮迭代编辑，已完成超过10个拷贝途径基因的定点整合。综述统计发现，过去五年中报道的最高效案例可在一次转化中获得>50%的六重基因编辑克隆，极大压缩了菌株构建周期。
**5. 碱基编辑与先导编辑的初步探索**
为规避DNA双链断裂带来的非预期重排，腺嘌呤碱基编辑器(ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在*Y. lipolytica*中被尝试。内含断裂去氨基酶与nCas9融合，可在特定sgRNA靶向窗口内实现A→G或C→T的精准转换，无需供体DNA且不依赖HDR。当关键氨基酸密码子位于编辑窗口时，CBE可直接引入提前终止密码子实现基因失活，效率约40%~70%。先导编辑(PE)，即nCas9融合反转录酶并携带pegRNA，可实现12种碱基替换及小片段插入/缺失，在*Y. lipolytica*中的初步应用已能完成点突变精确导入，但效率仍有较大提升空间（当前报道最高~30%），主要瓶颈在于pegRNA稳定性与逆转录效率。
在应用层面，综述映射了产物谱系：通过增强乙酰辅酶A供应并敲除β-氧化，结合多轮CRISPR编辑，总脂质含量可达**90%以上细胞干重**；赤藓糖醇滴度超过200 g/L；β-胡萝卜素产量突破4 g/L；此外，在重组人源蛋白（如脂肪酶、干扰素）分泌表达方面，借助CRISPR工具优化折叠与分泌途径，产量亦有数量级提升。这些案例证明了CRISPR技术对该酵母工业潜能的全面释放。
讨论与展望
尽管成就斐然，综述明确指出若干挑战。(i) **编辑通量与深层特征不明**：虽然可实现多重编辑，但多位点同时切割时染色体重排概率增加，且对基因组重编程的全局适应性影响缺乏系统评估。 (ii) **非模式PAM依赖与效率不均**：基因组许多重要功能位点仍无合适PAM，需要进一步挖掘Cas13、Cas14等新型核酸酶或进行Cas蛋白定向进化。 (iii) **递送瓶颈**：对于工业常用但无营养缺陷标记的原养型菌株，基于CRISPR系统的基因组纯净编辑（无外源DNA残留）依赖RNP瞬时转化，但电转条件优化及通用性仍存问题。 (iv) **非标准底盘特殊机制**：*Y. lipolytica*的强NHEJ偏好在破坏基因时有利，但在精确编辑时则需抑制，但长期抑制修复途径可能影响基因组稳定性。
展望未来，综述提出四个重点方向：**一是**整合计算工具与机器学习模型，预测高效sgRNA并设计全基因组规模扰动文库，加速代谢途径“设计-构建-测试-学习”循环；**二是**开发稳定游离质粒或人工染色体，实现不依赖整合的多基因途径模块化组装；**三是**构建标准化Golden Gate或MoClo兼容CRISPR质粒工具包，并建立开放共享社区，降低进入壁垒；**四是**结合合成生物学自动化硬件（如液体处理工作站），将菌株构建从人工操作推向高通量化。可以预见，CRISPR技术将继续作为*Y. lipolytica*系统代谢工程的中流砥柱，推动其成为工业生物技术中不可或缺的绿色细胞工厂。
**参考来源**
Dias R. G., Freitas F. P. M., Barbosa S., et al. 10 years of CRISPR/CAS genomic engineering in *Yarrowia lipolytica*. *Bioprocess and Biosystems Engineering*, DOI: 10.1007/s00449-026-03347-1.
DOI: 10.1007/s00449-026-03347-1