来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
番茄红素因其强抗氧化活性和在食品、医药领域的广泛应用而备受瞩目。利用微生物细胞工厂高效合成番茄红素已成为绿色制造的研究热点，而**谷氨酸棒杆菌**（*Corynebacterium glutamicum*）凭借其高安全性和甲羟戊酸途径的天然优势，正成为极具潜力的底盘宿主。近期，Zhan 等人在《*Microorganisms*》上发表的研究，创新性地**拓展了适用于该菌株的 CRISPR 工具箱**，通过多层次的基因表达调控对番茄红素合成途径进行了系统重构，实现了产量的大幅跃升。这项工作不仅提供了一株高性能的番茄红素生产菌，更为代谢工程中的精准调控树立了新的范式。
研究背景
番茄红素是自然界中最有效的单线态氧淬灭剂之一，在心血管疾病预防、抗癌和延缓衰老等方面展现出卓越的生理功能。传统上，番茄红素主要依赖天然植物提取，但生产周期长、占地广且受季节影响，难以满足日益增长的市场需求。微生物发酵法因生产周期短、可控性强、不占用耕地等优势，成为替代提取法的主流方向。
谷氨酸棒杆菌是经典的工业氨基酸生产菌株，其生物学背景清晰且被公认为**GRAS（一般公认安全）** 菌株。尤为重要的是，该菌具备内源的**2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径**，能够为类胡萝卜素合成提供丰富的前体。然而，野生型谷氨酸棒杆菌并不会积累番茄红素，需通过代谢工程手段引入外源八氢番茄红素合成酶（CrtB）和八氢番茄红素脱氢酶（CrtI）等基因，同时对其中心碳代谢进行改造以增强前体供给。已有的研究多集中在过表达途径关键酶或敲除竞争支路，但传统基因操作方法一次仅能操作一个靶点，周期冗长且难以实现全代谢网络的协同优化。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术的出现彻底改变了基因组编辑的面貌。在谷氨酸棒杆菌中，基于 Cas9 的 CRISPR 系统已被初步建立，但受限于单一的同源重组敲除或有限的转录抑制。**扩展 CRISPR 工具箱**，特别是引入转录激活（CRISPRa）、转录干扰（CRISPRi）以及碱基编辑等多元化调控模块，在同一细胞工厂内同时执行“抑制旁路、活化主路、微调内源基因”的多维调控策略，是突破合成生物学瓶颈的关键。该研究正是针对这一空白，致力于开发一套适用于谷氨酸棒杆菌的、功能层次丰富的 CRISPR 调控体系，并以其驱动番茄红素合成途径的精细化工程。
研究方法
为了实现上述目标，研究团队设计了一套层层递进的实验方案，技术路线可概括为四个核心步骤：
**1. CRISPR 功能模块的构建与适配优化**
首先，研究人员选择了来源于化脓链球菌的催化失活型 Cas9（dCas9）蛋白作为底盘支架，分别构建了**CRISPR干扰（CRISPRi）** 和**CRISPR激活（CRISPRa）** 模块。针对谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性对 dCas9 基因进行优化，并筛选了组成型与诱导型启动子来精准控制其表达水平。对于 CRISPRi，将 dCas9 与特定的负调控结构域（如 TXN）融合；对于 CRISPRa，则将 dCas9 与转录激活因子（如 SoxS 的活性域或直接以 RNA 聚合酶ω亚基融合）偶联。同时，为了提高多靶点并行操作的效率，团队还引入了 **CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统**，利用其加工自身 crRNA 阵列的能力，简化多元件操纵的质粒构建流程。
**2. 高效前体供给途径的搭建**
在宿主菌的选择上，使用了一株已预先弱化竞争途径的谷氨酸棒杆菌底盘。研究者利用 **CRISPRi 多重抑制技术**，同时下调了番茄红素合成竞争途径中的关键基因，如将磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS）中的相关基因或野生型类胡萝卜素糖基转移酶基因 *crtX* 进行转录干扰，以阻断前体向副产物的流失。同时，过表达内源的 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因 *dxs* 和异戊烯焦磷酸异构酶基因 *idi*，但通过不同强度的启动子进行表达微调，以此平衡MEP途径的代谢通量。
**3. 番茄红素合成途径的多模态调控**
在引入外源的番茄红素合成基因簇（*crtE*、*crtB*、*crtI*）后，利用 **CRISPRa 系统**，在基因组层面上靶向激活这三个基因所在的操纵子。通过设计一系列靶向启动子区域的 sgRNA，系统性扫描了激活效率最高的“热点”区域。同时，采用碱基编辑系统（如 nCas9 融合胞嘧啶脱氨酶）对内源基因的核糖体结合位点（RBS）进行饱和突变，以期在不改变编码氨基酸序列的前提下，精细上调 MEP 途径至番茄红素合成支路的关键酶表达量，从而匹配合成途径末端的代谢拉力。
**4. 发酵培养与产物分析**
工程菌株首先在摇瓶中进行初步评估，采用 CGXII 基本盐培养基并补充适量葡萄糖作为碳源。通过响应面法优化了初始碳氮比、诱导剂浓度和诱导时机。随后，在 5 L 发酵罐中进行分批补料发酵，通过指数流加策略控制比生长速率，并结合在线溶氧和 pH 反馈系统，使菌体在经历高密度生长后进入持续的生产阶段。番茄红素的提取采用有机溶剂萃取法，并利用高效液相色谱（HPLC）进行定量分析，每个靶点改造的效果均由荧光报告系统或直接测定中间代谢物浓度辅以验证。
研究结果
通过上述系统性研究，团队获得了一系列突破性发现，其核心数据清晰勾勒出新型工具箱的强大潜力：
**CRISPR 工具箱性能对比与最优化组合**
研究发现，不同 CRISPR 工具在谷氨酸棒杆菌内的调控效率存在显著差异。CRISPRi 在靶向 *crtX* 等基因时，仅需单一的 sgRNA 即可实现 90% 以上的表达抑制，且不同 sgRNA 的抑制强度呈现梯度分布，这为代谢流量的精细重排提供了量化的“调谐旋钮”。在 CRISPRa 方面，靶向 *crtEB* 操纵子启动子–35 和–10 区之间的 sgRNA 使基因表达上调了近 **15 倍**，显著优于传统的引入强启动子或增加基因拷贝数的方法。尤为突出的是，Cas12a 系统凭借多基因同步操控的优势，将四个靶点的协同编辑效率从传统的分步法累计不足 10% 一次性地提升至 **近乎 100%**，成为多元件路径重构的首选工具。
**番茄红素合成途径的系统性重构**
通过组合 CRISPRi 和 CRISPRa，研究人员在单一菌株中成功实现了“推–拉–抑”三个层次的代谢流控制。“推”：利用点突变和 RBS 工程，将关键前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）的胞内浓度提高了 3.2 倍；“拉”：CRISPRa 介导的 *crtI* 基因激活，使番茄红素合成速率明显加快，中间产物八氢番茄红素几乎无积累；“抑”：以 CRISPRi 下调了负责类胡萝卜素降解或糖基化的内源基因，副产物几乎消失。经此系统性重构的最佳菌株，在摇瓶水平上番茄红素产量从出发菌株的 12 mg/L 跃升至 **658 mg/L**，含量达到细胞干重的 2.8%。
**发酵放大验证与产物纯度**
在分批补料发酵中，该工程菌株展现了良好的工业适应性。通过精准控制比生长速率在 0.08 h⁻¹，发酵 72 小时后，**番茄红素终产量高达 2.1 g/L**，这是当时谷氨酸棒杆菌中报道的最高产量之一。值得注意的是，产物组分分析显示，番茄红素的纯度超过 **96%**，表明旁路代谢被有效抑制，代谢通量高度专一。此外，对发酵过程中 NADPH 和 ATP 水平的动态监测表明，改造后的菌株在进入生产期后能量和还原力供应充足，未出现明显的代谢负担或生长抑制现象。
讨论与展望
该项研究通过对多种 CRISPR 工具的并行开发和巧妙组合，精准定义了谷氨酸棒杆菌中转录干扰、转录激活和碱基编辑的多个工作参数，首次证实了在该菌内“多层级、多靶点、可预测”地进行代谢网络重塑的可行性与高效性。其最突出的启示在于，**单纯提升基因表达量或敲除竞争支路已非最优解，关键在于借助量化调控工具找到代谢网络中的最佳流量分配点**。例如，只需将 *dxs* 的表达上调至适度的 3 倍而非更高，即可避免产生有毒中间体并实现最高的番茄红素转化率。
从更为广阔的视角来看，该研究建立的 CRISPR 工具套件具有极强的通用性和可移植性。无论是用于生产其他类胡萝卜素（如虾青素、β-胡萝卜素），还是扩展至氨基酸、有机酸等谷氨酸棒杆菌的优势产品，这套工具都可以作为“即插即用”的调控模块，大幅缩短菌株构建周期。未来，整合无疤痕的多重基因组编辑与计算辅助的启动子设计，动态响应发酵环境的遗传回路，乃至引入光控或化学诱导的 CRISPR 调控开关，将使得代谢工程进入真正的“自适应精密发酵”时代。尽管目前仍存在 Cas 蛋白持续表达导致的潜在脱靶风险以及多质粒系统的代谢负荷等挑战，但随着高保真 Cas 变体和基因组整合型调控元件的不断完善，基于梭菌底盘的高效生物制造势必迎来新一轮爆发。
参考来源
Zhan Z, Chen X, Ye Z, Zhao M, Li C. Expanding the CRISPR Toolbox for Engineering Lycopene Biosynthesis in *Corynebacterium glutamicum*. *Microorganisms*. 2024; 12(4):803. DOI: [10.3390/microorganisms12040803](https://doi.org/10.3390/microorganisms12040803)
DOI: 10.3390/microorganisms12040803