来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
微藻作为“绿色细胞工厂”在合成生物学领域备受瞩目，但高效的基因组编辑工具一直是其底盘开发的瓶颈。近日，一项发表于《ACS Synthetic Biology》的研究推出了名为PHYCUT的多重CRISPR/Cas9编辑系统，首次在模式硅藻——三角褐指藻中实现了可扩展、高效率的多基因同步敲除。该技术突破了传统单基因编辑的局限，允许研究人员一次性靶向多达六个基因组位点，编辑效率高达65%以上，为构建复杂的藻类生物合成线路、推进碳中和生物制造提供了强大的遗传操作平台。（DOI: 10.1021/acssynbio.5c00843）
研究背景
硅藻是一类具有硅质细胞壁的单细胞真核微藻，承担着全球约20%的初级生产力。其中，三角褐指藻（*Phaeodactylum tricornutum*）凭借其清晰的遗传背景、较短的生长周期以及丰富的脂质积累能力，已成为合成生物学中的明星底盘。通过改造其代谢网络，可实现类胡萝卜素、ω-3长链多不饱和脂肪酸（如EPA）等高值产物的光自养合成，在功能食品、生物能源和碳封存领域潜力巨大。
然而，与大肠杆菌、酿酒酵母等成熟底盘相比，三角褐指藻的基因组工程工具仍显匮乏。尽管CRISPR/Cas9系统已被成功引入并实现了单基因靶向突变，但当代谢工程需要同时扰动多个基因（如敲除竞争途径、强化合成流）时，就面临着严峻挑战：传统的逐个基因编辑策略耗时费力，且由于硅藻细胞壁对DNA递送的物理屏障，重复转化还易导致细胞活力下降和脱靶效应累积。此前虽有多重gRNA串联表达的尝试，但常因载体构建复杂、gRNA表达盒相互干扰、基因组编辑效率不均一而受限。如何开发一种模块化、可扩展且高效的多重编辑工具，成为解锁硅藻底盘潜力的关键突破口。
研究方法
为解决上述难题，研究团队设计并构建了PHYCUT（*Phaeodactylum* CRISPR/Cas9 Utility Tool）系统，其核心是一套基于**Golden Gate模块化克隆**的多gRNA串联组装策略。具体技术路线如下：
**1. 载体骨架与Cas9表达模块优化**
研究者首先筛选了对三角褐指藻高效的人源密码子优化SpCas9基因，并将其置于内源性高表达启动子（如*EF2*启动子）和终止子（*fcpA*终止子）下，构建出稳定的Cas9组成型表达盒。为提高编辑活性，还引入了SV40核定位信号。该表达盒被整合至含有营养缺陷型筛选标记（如*URA3*）的游离质粒中，便于阳性克隆筛选。
**2. 多gRNA串联体系的“一锅法”组装**
这是PHYCUT最具创新性的设计。传统多重gRNA构建多依赖逐步酶切连接，周期长且有重组不稳定风险。团队采用Ii型限制性内切酶Bsal介导的Golden Gate反应，将多个独立的gRNA转录单元一次性定向组装至目的载体。每个gRNA转录单元包含：一个经筛选的强RNA聚合酶III启动子（如拟南芥*U6*或内源*U6*启动子）、20 bp靶向序列、gRNA骨架以及Poly-T终止信号。通过设计独特的4碱基粘性末端接头，研究者将多达6个gRNA表达盒按设计顺序无缝串联，整个反应在单管内1小时即可完成，真正实现了“即插即用”的模块化设计。
**3. 转化与突变检测流程**
携带Cas9表达盒和多gRNA串联模块的质粒，通过优化的大肠杆菌接合转移法导入三角褐指藻。接合法可高效穿透硅质细胞壁，克服了传统基因枪或电穿孔法的损伤大、拷贝数不均等缺陷。转化子经5-氟乳清酸（5-FOA）筛选和营养缺陷型复原验证，再利用二代测序和T7EI酶切法对靶位点进行基因型鉴定。此外，为了评估脱靶效应，团队对预测的潜在脱靶位点进行了深度靶向测序，并借助全基因组重测序对一株六重编辑藻株进行全局审视。
研究结果
该系统在三角褐指藻中表现出了令人瞩目的多重编辑性能，核心数据与发现如下：
**1. 高效率的单基因与多基因同步敲除**
以硝酸还原酶基因（*NR*）、尿嘧啶合成基因（*URA3*）以及侧生鞭毛蛋白基因（*LHL1*）为模型靶标，单gRNA编辑效率可达87%。当同时转入3个gRNA表达盒时，三基因同时敲除的效率高达67%，且三个位点的独立编辑率均超过80%。进一步挑战极限，将靶向6个不同染色体位点的gRNA阵列一次性导入后，仍然能够获得所有六个靶位点均发生突变的克隆，六重完全敲除效率约为12%。这一结果标志着硅藻多重基因组编辑首次突破了“三靶点瓶颈”。
**2. 靶向大片段的染色体删除**
利用双gRNA靶向同一染色体臂的远端，PHYCUT成功诱导了基因组大片段缺失。例如，通过靶向*LHL1*基因上下游各设计一个gRNA，团队获得了长约5.8 kb的精确缺失突变株，删除效率达到31%。这为移除冗余基因簇、消除内源性病毒序列或重塑染色体结构提供了新手段。
**3. 高保真性与低脱靶率**
对19个预测脱靶位点的深度测序显示，即使在多重编辑背景下，未检测到任何由Cas9引起的非预期突变。全基因组重测序的六重敲除株与野生型比对，仅发现靶点区域预期的插入/缺失突变，未见其他结构变异。这证实了PHYCUT在高度多路复用操作下仍保持着卓越的编辑特异性，为后续产业化应用的生物安全评估奠定了基础。
**4. 代谢通路的多节点快速重构**
为验证PHYCUT在代谢工程中的实用性，研究者在一次实验中同时敲除了类胡萝卜素合成竞争支路中的两个关键酶基因（*ZEP*和*LUT1*），并结合*PSY*基因过表达，成功使β-胡萝卜素产量提高了3.2倍。这一案例清晰地展示了该工具在藻类天然产物生物合成快速优化中的强大能力。
讨论与展望
PHYCUT的问世为硅藻合成生物学树立了新的技术标杆。其模块化、标准化的组装范式，使得构建不同尺度gRNA组合文库变得极为便捷；同时，高通量编辑能力意味着研究者可以快速生成包含数千种基因型扰动的突变体库，结合后续的高通量筛选，将从“试错模式”直接跨入“设计-构建-测试-学习”的理性工程循环。对于藻类碳中和方案而言，利用PHYCUT系统深度重塑三角褐指藻的中心碳代谢、脂质合成和电子传递链，有望最大化光合固碳和脂质产率，推动其成为真正具有经济竞争力的“太阳能原油”细胞工厂。
当然，多重编辑克隆中完全六靶点突变的效率（12%）表明高负荷gRNA可能仍存在表达干扰或毒性，未来需通过筛选更强或正交的Pol III启动子、优化gRNA顺序和引入自切割核酶等策略进一步提升。此外，将Cas9替换为碱基编辑器或先导编辑器，并与PHYCUT组装框架融合，或能实现不依赖DNA双链断裂的多重精准点突变，进一步拓展硅藻基因组工程的宽度。可以预见，随着PHYCUT类工具在多种微藻中的拓展，以光合底盘的制造业正加速从蓝图迈向现实。
参考来源
Stuckless E E, Gai L, Slattery S S, et al. PHYCUT: Scalable Multiplex CRISPR/Cas9 Editing for Genome Engineering in the Diatom *Phaeodactylum tricornutum* [J]. ACS Synthetic Biology, 2025. DOI: 10.1021/acssynbio.5c00843.
DOI: 10.1021/acssynbio.5c00843