来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
微生物代谢工程的核心目标之一是通过对底盘细胞的系统改造，实现目标产物的高效合成。然而，传统基因组编辑手段在面对多基因协同调控时往往力不从心，尤其是对于工业发酵中广泛使用的酿酒酵母。近期，山东大学微生物技术国家重点实验室张友明教授团队在《Microbial Cell Factories》发表了一项突破性研究，报道了一种名为SRLC的新型多重基因组编辑技术，并在酿酒酵母中首次实现了丙二酰辅酶A途径的多位点同步优化，显著提升了高价值黄酮类化合物的产量。该技术为酵母细胞工厂的快速构建提供了高效、精准的工具箱，也为复杂天然产物的异源合成开辟了新路径。
研究背景
酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）凭借其优秀的食品安全性、成熟的发酵工艺以及完整的真核内膜系统，已成为合成生物学与代谢工程领域最重要的底盘细胞之一。以白藜芦醇、柚皮素为代表的黄酮类化合物，因其强大的抗氧化、抗炎及抗癌活性而备受医药和保健品行业关注。它们的核心前体物质——丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）在胞内的丰度，直接决定了目标产物的碳流分配效率与最终产量。
然而天然的代谢网络中，丙二酰辅酶A的供应极为有限。它不仅是脂肪酸合成途径的关键前体，还受到严格的多层次调控。因此，研究者常通过过表达乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）、敲除竞争途径关键基因或加强前体乙酰辅酶A供给等策略来增强其胞内积累。问题在于，这些靶点分布在基因组的不同位置，涉及的修饰类型涵盖基因敲除、启动子替换和基因过表达。使用传统的一次只编辑一个位点的方法，不仅周期漫长，而且难以揭示多位点组合扰动带来的协同效应。
CRISPR/Cas9系统的出现极大地推动了酵母基因组编辑的多元化发展，但多数已报道的酵母多重编辑技术仍面临挑战：一方面，多个gRNA表达盒的串联构建过程繁琐，容易导致质粒不稳定；另一方面，高效率的同源重组要求供体DNA在断裂位点局部达到高浓度，而传统共转化策略在多靶点情况下往往会造成供体稀释，降低编辑效率。因此，迫切需要开发一种能够简化载体构建、稳定表达多重gRNA并高效递送修复模板的通用技术平台。
基于此，张友明团队创新性地设计了SRLC（Single-RNA-Linked-Cassette）系统，将多重gRNA的表达与编辑供体组装整合进一个高度紧凑的质粒骨架中，并通过优化RNA加工机制，同时在酿酒酵母基因组上实现高达五个位点的精准修饰，极大地加速了丙二酰辅酶A途径的工程化改造进程。
研究方法
SRLC技术的设计思路源于对酵母细胞自身RNA代谢机制的巧妙利用。研究者没有采用传统的每个gRNA依赖独立启动子和终止子的表达策略，而是构建了单一转录本串联排列的“gRNA-tRNA”阵列。具体而言，他们将多个靶向不同基因组位点的gRNA序列，两端镶嵌以酵母内源tRNA序列，全部置于一个强效RNA聚合酶III启动子SNR52之下。该转录本在核内生成后，细胞内的tRNA加工系统——RNase P与RNase Z会精准识别并切割tRNA的前体结构，从而释放出成熟的、功能完备的单个gRNA。这一策略不仅使多个gRNA的表达高度均一，而且显著压缩了表达盒的空间，使得单个质粒承载5个甚至更多gRNA成为可能。
技术路线的第二个关键创新点在于编辑模板的胞内原位释放。传统的多重供体DNA常以游离片段形式与质粒共转化，但片段种类和数量的增多会严重降低共进入同一细胞的概率。SRLC系统巧妙地将各个靶位点对应的同源修复模板直接克隆到gRNA表达质粒上，两端嵌入I-SceI归巢内切酶的识别序列。当质粒进入酵母细胞后，组成型表达的I-SceI将线性质粒化，切下的供体片段瞬时在核内高浓度富集，并与Cas9切割形成的双链断裂位点进行高效同源重组修复。为降低背景干扰，质粒骨架中还引入了酵母自主复制序列（ARS）和着丝粒（CEN）元件，保证了其低拷贝稳定存在，同时在完成编辑后可通过传代丢失，实现无痕操作。
为验证SRLC的多功能性，团队设计了从单基因操作到五重协同编辑的梯度实验。在丙二酰辅酶A途径优化实例中，他们选定了以下靶标：（1）敲除*YPL062W*（参与脂肪酸合成的竞争性乙酰辅酶A消耗）；（2）利用强组成型启动子*TDH3p*替换乙酰辅酶A羧化酶*ACC1*的天然启动子，以增强其转录水平；（3）在*HO*位点整合额外拷贝的*ACC1*表达盒；（4）敲低*FAA1*和*FAA4*（长链脂酰辅酶A合成酶），阻断丙二酰辅酶A流向磷脂合成。每个编辑位点均设计了约500 bp的同源臂，并通过SRLC质粒一步转化同时完成。研究还通过荧光报告体系、Sanger测序和全基因组测序对编辑效率、脱靶效应进行了系统性评估。
研究结果
SRLC系统展现了令人瞩目的编辑性能。单基因编辑（如*ADH2*敲除）效率接近100%，且操作周期缩短至传统方法的1/3。在双重、三重乃至五重编辑实验中，研究团队观察到一个重要趋势：当gRNA数目从2增加到5时，所有靶点同时发生所需编辑的概率依然维持在高水平。定量测定表明，五重编辑的平均效率可达68%以上，远超以往报道的酿酒酵母一步多重编辑数据（通常低于30%）。对外显子区域的深度测序证实，编辑精准集中在设计位点，未检测到显著的非靶向突变，体现出高保真性。
利用SRLC对丙二酰辅酶A途径进行的五重工程化改造取得了显著的代谢通量重分布效应。工程菌株与野生型相比，胞内丙二酰辅酶A的浓度提高了多达12.4倍。这一高丰度的前体供给被直接用于白藜芦醇的发酵合成测试。当将白藜芦醇合成模块额外整合入上述丙二酰辅酶A高产底盘后，摇瓶发酵产量达到238.6 mg/L，为改造前的6.9倍。进一步补料分批发酵优化，白藜芦醇终产量突破800 mg/L大关，是当时已报道酿酒酵母从头合成白藜芦醇最高水平之一。
代谢谱分析揭示了各编辑靶点对通量的贡献差异。敲除*YPL062W*和下调*FAA1/FAA4*均单独贡献了约2～3倍的丙二酰辅酶A增幅，而启动子替换*ACC1*和增加其拷贝数则带来了协同倍增的效果。值得注意的是，多重编辑并非简单加和：某些组合表现出明显的协同正效应，而过度敲除竞争途径则可能引发细胞生长迟滞。SRLC使研究者可以快速构建并评估一系列组合文库，从而锁定最优的基因型组合，这在传统的逐级编辑模式下几乎是不可能完成的任务。
讨论与展望
SRLC技术的建立，不仅仅是一项编辑效率的提升，更代表着一种设计理念的跃迁。tRNA介导的gRNA串联释放与I-SceI驱动的供体原位切割释放，共同构成了一个高度模块化、可平行扩展的遗传改造平台。研究者可以像搭积木一样，在数天内完成从设计到获得多靶点突变株的全流程，为酿酒酵母的代谢工程带来了类似于自动化装配线的便利性。
就丙二酰辅酶A途径而言，本研究证明通过精准重构中心碳代谢与脂代谢的接口，可以极大限度地拉高这一关键前体的代谢通量。这不仅有利于黄酮类、芪类化合物的生产，对于脂肪酸衍生物、聚酮化合物等同样依赖丙二酰辅酶A的家族都有着直接的借鉴意义。800 mg/L的白藜芦醇产量显示了该平台从实验室走向工业化的巨大潜力，后续若能结合辅因子平衡、产物胞外转运优化和适应性进化，有望达到极具商业竞争力的生产强度。
当然，SRLC仍有进一步拓展的空间。当前系统的编辑容量受限于单个质粒的遗传稳定性，若要同时突破十个以上位点，可能需要结合染色体整合型gRNA阵列或引入可诱导Cas9表达体系，以降低长时间内核酸酶毒性。此外，将SRLC与高通量表征技术（如微流控单细胞分析）和计算设计工具（如基因组规模代谢模型）深度整合，将能够在更大的设计空间内探寻菌株的最优解，真正开启酵母代谢工程的全基因组理性设计时代。
参考来源
Zheng W, Wang M, Tu Q, et al. Establishment of SRLC: a multiplex genome editing technology for *Saccharomyces cerevisiae* and its application in metabolic engineering of malonyl-CoA pathway. *Microbial Cell Factories*, DOI: 10.1186/s12934-026-03068-w.
DOI: 10.1186/s12934-026-03068-w