来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
鲁福霉素（rufomycin）是一类具有抗分枝杆菌活性的环状七肽天然产物，对结核分枝杆菌等顽固病原体展现出独特抑制效果。然而，野生型链霉菌生产菌株产量极低，严重制约其药物开发进程。Su等人在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表的研究中，巧妙整合CRISPR/Cas9精准基因组编辑与启动子工程两大合成生物学策略，对海洋链霉菌 *Streptomyces* sp. MJM3502 进行系统改造，最终将鲁福霉素产量提升了近20倍。该工作不仅为鲁福霉素的工业化发酵奠定了基础，也为链霉菌来源的低产天然产物高效激活提供了通用范例。
研究背景
结核病至今仍是全球十大死因之一，耐药结核分枝杆菌的蔓延更使传统化疗面临严峻挑战。鲁福霉素最初从溪谷链霉菌（*Streptomyces atratus*）中分离获得，其核心骨架由七个氨基酸以酰胺键首尾环合而成，并带有特征性异丁烯基色氨酸残基。作用机制研究表明，鲁福霉素通过靶向分枝杆菌的ClpC1-ClpP蛋白酶复合物，诱导不可逆的蛋白降解，从而杀死休眠态和复制态分枝杆菌，对单药耐药及多重耐药菌株均保持低微摩尔级的效力。这一全新作用模式使鲁福霉素成为极具前景的抗结核先导分子。
然而，已报道的天然生产菌株鲁福霉素发酵效价长期徘徊在毫克每升级别，且遗传操作体系匮乏，无法通过常规代谢工程手段提高产量。*Streptomyces* sp. MJM3502是从海洋沉积物中分离的鲁福霉素产生菌，其生物合成基因簇（*ruf* 簇）已得到鉴定，包含非核糖体肽合成酶（NRPS）、异戊烯基转移酶、甲基转移酶及环化酶等核心功能模块。但基因簇内部及周边存在大量转录调控未知的操纵子，且菌株本身产孢和次级代谢网络复杂，传统的敲除竞争途径或过表达正调控因子的策略往往效率低下。近年来，CRISPR/Cas9系统在多种链霉菌中成功实现了高效无痕的基因组编辑，可精准删除负调控元件、插入组成型强启动子，为隐秘生物合成基因簇的激活和产量提升开辟了新路径。基于此，该研究首次将CRISPR/Cas9工具应用于 *Streptomyces* sp. MJM3502，并结合启动子置换策略，试图突破鲁福霉素的产量瓶颈。
研究方法
作者首先建立了适用于 *Streptomyces* sp. MJM3502 的高效CRISPR/Cas9编辑体系。选用温敏型pGM1190质粒为骨架，构建同时携带Cas9表达盒、sgRNA转录单元和同源修复模板的敲除/替换载体。针对 *ruf* 簇内及周边的候选负调控基因及原始启动子区域，设计20 bp特异性引导序列，并克隆至sgRNA骨架上游。同源臂长度选取1.5–2.0 kb，确保重组修复效率。将构建好的质粒通过接合转移导入目标链霉菌，在37°C下培养并加入10 mM茶碱诱导Cas9表达，使双链断裂产生；同时借助同源重组实现靶基因的缺失或启动子的精确替换。通过涂布无抗平板和影印筛选，轻松获得质粒丢失的编辑菌株，再经PCR产物测序和Southern blot确认无痕编辑。
在挖掘编辑靶点方面，作者系统分析了 *ruf* 基因簇的转录结构。利用RT-PCR和5′-RACE确定了各操纵子的转录起始位点，鉴定出21个转录单元。其中，*rufV* 编码一个含有LuxR型DNA结合域的转录调控因子，其基因敲除可能解除对下游合成基因的抑制。另一方面，驱动NRPS基因 *rufA* 和 *rufB* 的天然启动子活性极弱，成为限制代谢流向终产物的主要瓶颈。因此，研究团队设计了两条平行的工程路线：（1）利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，无痕删除 *rufV* 编码区，彻底消除其潜在的转录阻遏作用；（2）分别以组成型强启动子P*ermE\**、P*kasOp\**以及串联重复启动子P*ermE\*–P*kasOp\**替换 *rufA* 和 *rufB* 转录单元前的原启动子，比较不同强度启动子对产量的影响。同时，对 *rufV* 缺失菌株进一步叠加启动子工程，构建双靶点协同强化菌株。
发酵评估采用改良ISP2培养基，在28°C下于挡板摇瓶中进行，每24小时取样一次。发酵液经乙酸乙酯萃取后，利用UPLC-QTOF-MS/MS在负离子模式下检测鲁福霉素A和B的分子离子峰（m/z 1071.5和1085.5）及特征二级碎片，并以标准品绘制标准曲线进行绝对定量。同时，通过RT-qPCR检测关键合成基因（*rufA*, *rufC*, *rufP*）的转录水平；采用荧光显微镜和流式细胞仪监测编辑菌株的菌丝形态与产孢状态，排除产量增加源于生物量异常堆积的可能性。
研究结果
CRISPR/Cas9编辑体系在 *Streptomyces* sp. MJM3502中的平均编辑效率达到58%，其中*rufV*基因缺失的成功率高达72%。Δ*rufV*单敲菌株在发酵第8天鲁福霉素总效价达到 (82.4 ± 6.1) mg/L，较野生型（(4.5 ± 0.7) mg/L）激增约17.3倍。UPLC图谱显示，Δ*rufV*菌株不仅鲁福霉素A（主成分）色谱峰面积显著增大，鲁福霉素B及数个微量类似物的积累也同步增强，提示RufV作为全局性负调控因子，其缺失释放了整个 *ruf* 簇的转录活性。RT-qPCR验证了这一推论：Δ*rufV*中*rufA* mRNA水平上调32.5倍，*rufC*上调28.8倍，*rufP*上调15.3倍，表明核心NRPS装配线及环化酶的转录去阻遏效应极为强烈。
启动子工程实验获得了层级分明的产量梯度。单独用P*ermE\**替代*PrufA*后，鲁福霉素效价为 (35.7 ± 4.3) mg/L，是野生型的7.9倍；置换 *rufB* 上游启动子则得到 (47.2 ± 5.0) mg/L，提升10.5倍。将同一强启动子串联驱动双基因盒（P*ermE\*–P*ermE\**）并未引起产量进一步提升，推测单拷贝强启动子已基本使合成酶饱和。当使用更高效的P*kasOp\**元件时，单基因置换即达到 (68.9 ± 5.8) mg/L (提升15.3倍)。最引人注目的是，在Δ*rufV*底盘菌株中进一步置换 *rufA* 和 *rufB* 启动子为P*kasOp\**，所得双编辑菌株Δ*rufV*/P*kasOp\**–*rufAB*在发酵第10天鲁福霉素总效价飙升至 (92.1 ± 5.4) mg/L，较野生型提高20.5倍，且鲁福霉素A纯度由74%提升至89%。稳定性实验证实，该高产菌株经历10次无抗传代后产量未出现回复衰减，证明无痕编辑未引入任何选择标记，具有工业化发酵潜力。
值得关注的是，编辑菌株的形态与生理指标保持正常。Δ*rufV*菌株在固体平板上产孢丰度与野生型无显著差异，液体发酵中菌丝体干重及生长曲线基本重叠。这说明产量提升并非由生物量增加或形态异常“应激”引起的非特异性分泌，而是精确地重新布线了碳氮代谢流向鲁福霉素装配线。此外，转录组轮廓分析还发现，*rufV*缺失不仅激活了 *ruf* 簇，同时轻微抑制了竞争性天然产物（如灵菌红素类色素）的基因簇转录，这也可能是碳前体更多流向鲁福霉素合成的原因之一。
讨论与展望
该研究成功实现了CRISPR/Cas9系统在海洋链霉菌 *Streptomyces* sp. MJM3502中的高效应用，证明一次性无痕删除负调控因子、同时引入组成型强启动子是大幅提高隐秘天然产物产量的可行技术路径。Δ*rufV*与P*kasOp\**协同工程菌株近20倍的效价跃升，尤其具有产业化吸引力。作者也指出，P*kasOp\**启动子在多拷贝或替换多个靶标时易引发质粒丢失和菌株不稳定，未来可通过染色体整合更多拷贝或使用强度可调的诱导型启动子精细调控合成通量。此外，RufV虽是全局性负调控因子，但其DNA结合基序和直接调控靶点尚不完全清楚，后续利用ChIP-seq和EMS-seq解析其全基因组调控网络，有望挖掘更多可操作靶点。
从更广视角看，大量链霉菌生物合成基因簇在实验室培养条件下处于沉默或低表达状态。该研究建立的“CRISPR/Cas9编辑——转录分析——启动子工程”三步流程，可快速移植至其他未开发菌株。结合高通量自动化克隆和基于机器学习的启动子强度预测，可能在未来几年内形成自动化天然产物平台。对鲁福霉素而言，产量突破后，发酵工艺优化（补料策略、前体添加）及下游高效纯化工艺将成为临床前研究推进的关键。同时，结构修饰亦是方向，利用编辑菌株高产中间体或类似物，可通过突变合成或化学半合成获得药代性质更优的衍生物。该工作为天然产物合成生物学树立了从基础编辑工具搭建到理性代谢工程提升产量的完整范例。
参考来源
Su C, Tuân N, Li WH, Cheng J, Jin Y. Enhancing rufomycin production by CRISPR/Cas9-based genome editing and promoter engineering in *Streptomyces* sp. MJM3502. *Synthetic and Systems Biotechnology*, 2025. DOI: 10.1016/j.synbio.2025.01.002.
DOI: 10.1016/j.synbio.2025.01.002