来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
L-亮氨酸作为支链氨基酸的重要成员，在医药、食品及饲料领域应用广泛，但其微生物发酵生产长期受困于复杂调控网络与代谢副产物制约。近期，一项发表于《Fermentation》的研究利用CRISPR相关转座酶（CAST）系统，对大肠杆菌基因组进行多重、精准且无痕的代谢通路改造，成功构建出L-亮氨酸高产菌株。该工作巧妙绕开传统质粒依赖与抗性标记的局限，实现了关键基因的原位过表达与竞争途径的同步阻断，将L-亮氨酸产量提升至全新高度，为微生物细胞工厂的理性构建提供了极具启发性的示范。
研究背景
L-亮氨酸（L-Leucine）是人体必需氨基酸之一，也是三种支链氨基酸（BCAAs）中疏水性最强的成员，广泛应用于肠外营养制剂、运动补充剂、药物中间体及饲料添加剂等领域。据统计，全球L-亮氨酸市场年增长率超过5%，高效、绿色的微生物发酵生产方式愈发受到产业界重视。
然而，L-亮氨酸的微生物合成绝非坦途。在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中，L-亮氨酸的生物合成源自丙酮酸，经乙酰羟酸合酶（AHAS）、乙酰羟酸异构还原酶（AH计算R）、二羟酸脱水酶（DHAD）及转氨酶等多步催化，最终由分支酸途径分流而成。该通路不仅与L-缬氨酸、L-异亮氨酸共享部分酶系，还受到严密的反馈抑制调控——关键酶AHAS I（由*ilvBN*编码）对L-缬氨酸敏感，而AHAS III（由*ilvIH*编码）则受L-亮氨酸强烈抑制。此外，转录衰减、竞争途径（如丙酮酸向乙酰辅酶A的流失）以及前体物α-酮异己酸的胞内供给不足，均构成高产道路上的“绊脚石”。
传统代谢工程策略多依赖质粒过表达关键基因，或通过化学诱变筛选高产株。但质粒系统存在代谢负担重、拷贝数波动、需抗生素维持等缺陷；而诱变育种则随机性大、遗传背景不清。近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术虽能实现无痕修饰，但在多重基因位点同时操作时效率急剧下降，且往往需依次循环操作，周期冗长。因此，亟需一种能够并行作用于多个基因组位点、精准嵌入大片段DNA且操作简便的新型编辑工具。
CAST（CRISPR-associated transposase）系统即在此背景下脱颖而出。该系统由CRISPR引导的转座酶复合体构成，通过crRNA编程，可将长达数十千碱基对的DNA片段特异性地整合至基因组靶位点，且不依赖双链断裂修复及同源重组，避免了脱靶毒性。Ren等人的研究正是抓住这一契机，将CAST系统引入L-亮氨酸生产菌株构建，试图一揽子解决途径强化、竞争阻断及调控解除等核心难题，为支链氨基酸高产平台开辟新路。
研究方法
该研究的技术路线极具层次感，可划分为底盘菌株初筛、CAST系统适配、多靶点组合改造及发酵条件优化四个主要阶段。
**底盘菌株与初始改造**
研究者以实验室保藏的一株L-亮氨酸基础生产菌E. coli LEU-1为出发菌株。该菌已预先通过解除*ilvBN*操纵子衰减子突变（*ilvBNatt*），部分释放了AHAS I的反馈抑制，并敲除了支链氨基酸分解代谢关键基因*ilvE*（支链氨基酸转氨酶），以减少产物降解。在此基础上，进一步删除了L-亮氨酸外排泵负调控基因*rhtA*，使胞内合成积累的L-亮氨酸更易分泌至胞外，缓解胞内毒性。
**CAST系统载体构建与功能验证**
CAST系统核心组件源自霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）Tn6677转座子。研究团队将Tn6677的转座酶基因（*tnsA*-*tnsB*-*tnsC*）与来源于*Streptococcus pyogenes*的nuclease-deficient Cas9（dCas9）融合表达，并在同一载体上装配人工设计的crRNA阵列，使得转座事件能特异性导向基因组上的目标序列。供体DNA（transposon payload）携带强组成型启动子PJ23119驱动的目标基因及作为筛选标记的*cat*（氯霉素抗性）基因，但两侧被转座子左端（LE）与右端（RE）序列环绕。当转座复合体识别靶点后，整个payload被“切割-粘贴”至基因组靶点下游的固定距离处，形成稳定整合。
为使CAST系统在大肠杆菌内高效运作，研究者对转座酶的表达水平、crRNA设计规则（靶点序列长度、GC含量及二级结构）进行了系统优化，最终确定以5'-TTG-3'作为整合位点的最适基序，并筛选出三条靶向不同基因组位点的高效crRNA。
**多重代谢改造策略**
基于L-亮氨酸合成通路的系统分析，研究团队制定了“推-拉-堵”相结合的组合改造方案：
1. **“推”——强化前体α-酮异戊酸供应**：在*ilvC*（乙酰羟酸异构还原酶）和*ilvD*（二羟酸脱水酶）基因上游原位整合强启动子，过表达这两个限速酶，推动碳流从丙酮酸向α-酮异戊酸方向流动。
2. **“拉”——过表达L-亮氨酸特异性路径酶**：将来源于*Corynebacterium glutamicum*的*leuA*（α-异丙基苹果酸合酶）基因整合至染色体，该酶催化α-酮异戊酸与乙酰辅酶A缩合，是进入L-亮氨酸专属路径的第一步。所用*leuA*为抗反馈抑制突变体（*leuAfbr*），可彻底摆脱产物抑制。
3. **“堵”——阻断碳流失竞争途径**：通过CAST系统将强转录终止子或基因敲除盒整合至*ldhA*（乳酸脱氢酶）、*poxB*（丙酮酸氧化酶）及*ackA*（乙酸激酶）位点，降低丙酮酸经乳酸、乙酸等副产物的碳流损失。
所有上述整合均以crRNA多重化形式同步进行——即在一个CAST反应周期内，同时递送针对多个靶位点的crRNA与对应供体DNA，一次转化完成多个基因位点的精准改造。
**发酵与分析方法**
改造后的菌株在摇瓶及5 L发酵罐中进行补料分批发酵评估。发酵培养基以葡萄糖为碳源，通过溶氧反馈流加控制残糖浓度。L-亮氨酸及副产物（L-丙氨酸、L-缬氨酸等）浓度采用高效液相色谱（HPLC）结合邻苯二甲醛柱前衍生法测定，胞内代谢中间体则经液质联用（LC-MS/MS）定量。基因组整合准确性经连接探针法PCR及Sanger测序验证。
研究结果
本研究成功构建了一系列梯度改造菌株，其核心数据清晰地展示了CAST系统多重编辑的协同增效作用。
**CAST系统展现出高效、精准的多重整合能力**
在优化条件下，同步三重整合效率达到62.5%，即每16个转化子中约10个实现了所有三个靶位点的正确整合，且均发生在外源DNA两端转座子特征序列处，未检测到脱靶插入。与逐次编辑相比，节约时间成本超过70%。整合的DNA片段最长可达8 kb（包含*leuAfbr*表达盒），且传代50代后仍保持超过98%的稳定性，表明基因组整合牢固。
**组合改造显著提升L-亮氨酸合成性能**
以LEU-1为出发菌，逐步叠加整合模块。最终菌株LEU-14（同时整合PJ23119-*ilvC*、PJ23119-*ilvD*、*leuAfbr*表达盒，并阻断*ldhA*、*poxB*、*ackA*）在摇瓶发酵中，L-亮氨酸产量达到21.3 g/L，较出发菌株（12.5 g/L）提高了70.4%，糖酸转化率由0.18 g/g增至0.25 g/g。值得关注的是，副产物L-缬氨酸的积累量从2.8 g/L显著下降至0.7 g/L，显示碳代谢流成功被“牵引”向亮氨酸特异性路径。
在5 L发酵罐补料分批发酵中，LEU-14菌株表现更为强劲。经48小时发酵，L-亮氨酸终浓度高达48.6 g/L，生产强度约1.01 g/(L·h)，糖酸转化率为0.27 g/g。该结果与当前报道的经多轮随机诱变或基因工程改造的工业菌株相比，已具备竞争力，且LEU-14构建全程仅耗时约4周，远低于传统策略。
**代谢流分析验证重编程效果**
通过LC-MS/MS测定胞内代谢中间体，发现LEU-14细胞内α-酮异戊酸浓度较出发菌株提高了2.1倍，α-异丙基苹果酸浓度提升3.4倍，而丙酮酸积累量下降42%，证实“推-拉-堵”策略有效重定向了中心碳代谢至L-亮氨酸合成。同时，乙酸、乳酸副产物浓度分别降低63%和78%，与基因阻断预期相符。
此外，研究者观察到发酵液中L-亮氨酸/总支链氨基酸比值由出发菌的72%上升至LEU-14的94%，意味着更高纯度的产品，十分有利于下游分离纯化。菌株在传代过程中产量未出现明显衰退，工业化前景明朗。
讨论与展望
该研究的最大亮点在于彰显了CRISPR相关转座酶系统在代谢工程中的独特优势。相较于CRISPR-Cas9依赖的HDR编辑，CAST系统无需诱导DNA双链断裂，对宿主基因组毒性更低，且转座酶的大片段携带能力允许一次整合包含启动子、目标基因、抗性筛选标记甚至多基因表达盒的完整模块，理论上可轻松实现代谢途径的“即插即用”。研究团队同时实现三个位点的同步编辑，且效率与精度均令人满意，为今后并行改造多个远距离位点提供了可靠范式。
从代谢工程科学性角度看，“推-拉-堵”组合策略再次被证实是解除复杂生物合成瓶颈的通用框架。值得深思的是，本研究虽大幅提升产量，但糖酸转化率仍停留在0.27 g/g，与理论最高得率（约0.64 g L-亮氨酸/g葡萄糖）尚有距离。后续可考虑通过辅因子工程（如加强NADPH供给）、中心碳代谢重排（如磷酸戊糖途径强化）或动态调控系统进一步逼近理论极限。此外，将CAST系统拓展至其他氨基酸衍生物、萜类、聚酮化合物的合成关键酶整合，前景广阔。
未来，CAST技术的优化方向可能包括：扩大crRNA靶点选择范围、开发可诱导或可逆的转座系统、实现无筛选标记的多重整合等。若与高通量自动化平台及机器学习预测模型相结合，有望在短时间内并行生成成千上万种代谢组合，加速“设计-构建-测试-学习”循环的迭代。总之，这项研究不仅提供了一株极具工业潜力的L-亮氨酸高产菌，更为合成生物学时代基因组工程工具箱增添了一件利器。
参考来源
Ren X, Li N, Li Z, Zhou Y, Lin Z. Enhanced L-Leucine Production in *Escherichia coli* via CRISPR-Associated Transposase Genome Engineering. *Fermentation*, 2025, 11(6): 314. DOI: 10.3390/fermentation11060314
DOI: 10.3390/fermentation11060314