来源：Life (Basel) | 编译：DNA Lab Space
细胞-free表达系统（Cell-Free Expression Systems）正以其独特的开放性和灵活性，为合成生物学开辟出一条迥异于传统活细胞工厂的技术路径。该系统无需维持细胞存活，能够将转录和翻译所需的全部分子机器在体外重组，直接以线性或质粒DNA为模板高效合成目标蛋白。近年来，随着 crude extract 制备工艺的优化、反应成本的降低以及反应规模的灵活可控，无细胞表达系统已从基础研究工具迅速蜕变为兼具高通量筛选、快速诊断和按需生物制造功能的多用途平台。该综述系统梳理了无细胞系统在膜蛋白合成、蛋白质工程、治疗性蛋白生产、代谢工程以及床边诊断等领域的突破性进展，指出这一技术范式正在深刻改变生物产品的设计与制造方式。
研究背景
传统基于活细胞的异源蛋白表达尽管在过去数十年中取得了巨大成功，但其固有局限日益凸显：细胞生长与产物合成争夺资源、跨膜转运瓶颈限制产物积累、膜蛋白或毒性蛋白对宿主细胞具有致死效应、以及克隆和发酵周期漫长难以满足即时生产需求。此外，开放阅读框的不可溶性表达常常导致包涵体形成，需繁琐的复性过程才能获得活性蛋白。面对这些瓶颈，无细胞表达系统展现出显著优势：由于没有细胞壁和细胞膜的物理屏障，反应体系可自由设计；无需维持细胞活性代谢，可将全部能量与底物通量导向目标产物合成；系统具备极高的耐受性，可表达对细胞有毒性的蛋白（如孔道形成蛋白、抗菌肽）；而且反应体积可从纳升扩展至百升级，展现出跨越多个数量级的可扩展性。该论文正是基于这一技术背景，系统论述了无细胞表达系统在生物技术多个前沿方向的应用潜力与实现路径。
研究方法
该论文采用文献综述的研究范式，系统检索并整合了无细胞表达系统在生物技术应用中的关键研究进展。作者团队梳理了无细胞系统的两大类核心平台：基于粗提物（crude extract）的系统（如大肠杆菌、小麦胚芽、兔网织红细胞裂解液等）和基于重组元件的PURE系统（Protein synthesis Using Recombinant Elements）。在技术路线层面，论文重点分析了无细胞系统的工程化改造策略——包括启动子/调控元件的模块化组装、CRISPR干扰技术对转录水平的精细调控、以及通过共表达分子伴侣和折叠催化剂提升蛋白可溶性等途径。
在具体应用层面，论文归纳出多条实验技术路线：其一，利用无细胞系统表达膜蛋白，通过添加脂质体、纳米盘或去垢剂形成疏水环境以稳定膜蛋白构象；其二，通过高通量平行反应进行蛋白质工程改造，如利用无细胞系统快速筛选突变体文库；其三，引入非天然氨基酸实现定点修饰，经工程化正交tRNA/氨酰tRNA合成酶对实现遗传密码扩展；其四，将无细胞系统与冻干或微流控技术结合，开发可在偏远地区常温储运的体外诊断试剂盒。论文还着重探讨了反应条件的系统优化策略——包括能量再生系统的选择（磷酸肌酸/肌酸激酶系统 vs. 丙酮酸氧化酶系统）、底物投料方式（分批补料或连续交换反应器）、以及pH和渗透压的维持。
此外，论文还详细描述了无细胞代谢工程的技术框架：通过将多步酶促反应途径（如非核糖体肽合成酶途径、聚酮化合物合成途径）在体外进行重构，规避了细胞内代谢调控网络对异源途径的干扰。这种“体外代谢工程”策略允许直接添加辅因子和底物前体，简化了产物分离纯化流程。论文还涉及无细胞系统的标准化和自动化——将表达反应整合至微流控芯片或液滴微反应器中，实现超高通量的反应条件筛选和产物定量分析，为系统的工业放大提供了重要数据支撑。
研究结果
论文总结了无细胞表达系统在多条应用赛道中的标志性实验结果与关键技术指标。
在膜蛋白研究方面，无细胞系统实现了包括G蛋白偶联受体（GPCRs）在内的数十种膜蛋白的高水平表达，产量可达毫克级/毫升反应体系，且通过添加纳米盘或脂质体能够获得具有天然构象的功能性膜蛋白。这为结构生物学研究开辟了便捷通道——无需经过细胞培养和膜蛋白提取的繁琐流程，从PCR模板到结构级别的蛋白样品仅需数小时。
在蛋白质工程领域，无细胞系统实现了真正意义上的“即用型”高通量筛选。研究者可将定点突变或随机突变库直接加入96孔或384孔板中进行平行表达和活性测定，单个工作日即可完成数百个突变体的构建-表达-筛选循环，较传统细胞筛选方法提速10-100倍。结合无细胞系统可便捷引入非天然氨基酸的特性，能够定向设计具有新催化活性或改良药代动力学特性的蛋白变体。
在治疗性蛋白生产方面，论文指出无细胞系统可直接表达具有二硫键的复杂治疗性蛋白（如抗体片段、细胞因子），通过调节氧化还原环境（如谷胱甘肽缓冲体系）促进正确二硫键形成。临床试验阶段的多种蛋白药物已可通过无细胞系统实现克级制备，且内毒素水平远低于传统大肠杆菌表达系统，极大简化了下游纯化工艺。
在代谢工程应用中，无细胞多酶催化系统实现了从简单碳源（如葡萄糖、甘油）到高价值化学品（如萜类、聚酮类天然产物）的体外转化。通过精细调控酶浓度比例和辅因子再生，部分途径的产率较体内发酵提升了一个数量级。论文特别强调了无细胞系统在“按需生产”场景中的独特价值——将冻干的无细胞反应组分与合成基因线路结合，可在不具备冷链物流的边远地区实现治疗性蛋白（如抗菌肽、解毒酶）的现场快速生产，从启动反应到获得活性产物仅需数小时。
在诊断应用方面，无细胞系统被用于构建低成本、便携式的分子诊断工具。基于无细胞系统的“分子计算”能够检测特定RNA或小分子标志物，通过级联放大产生可肉眼读取的颜色信号，灵敏度和特异性已可媲美传统qPCR方法。该平台被成功应用于寨卡病毒、埃博拉病毒等突发传染病病原体的现场快速检测，检测限达到皮摩尔级别，反应时间不超过90分钟。
讨论与展望
该综述明确指出，无细胞表达系统正经历从实验室工具向工业制造平台的深刻转型。其核心优势在于“设计的自由”——系统开放性和可编程性使得合成生物学的设计-构建-测试-学习循环能够在体外以更高速度和更低成本运行。然而，当前无细胞系统仍面临若干关键瓶颈：粗提物制备的批次间差异影响实验可重复性；反应体系中昂贵辅因子（如ATP、GTP）的持续供给推高规模化生产成本；蛋白质糖基化等翻译后修饰尚无法在现有原核无细胞系统中完整实现。
展望未来，论文提出以下几个值得关注的发展方向：建立更标准化、模块化的无细胞表达工具箱，开发可编程的自动化反应平台；推进无细胞系统在连续流动膜反应器中的长期运行，克服批式反应的产量上限；将合成生物学中成熟的基因线路设计原理引入无细胞系统，构建具有感知-决策-响应功能的算法代理外生物传感器；以及进一步探索嗜热菌、极端嗜盐菌等特殊微生物来源的无细胞系统，拓宽反应条件和产物类型的边界。随着细胞提取物成本持续走低和反应效率不断提升，无细胞表达系统有望成为合成生物学从概念验证走向实际应用的关键使能技术，在生物医药、绿色化工和全球健康领域释放更大潜力。
参考来源
Brookwell A, Oza JP, Caschera F. Biotechnology Applications of Cell-Free Expression Systems. Life (Basel). 2021, 11(12): 1367. DOI: 10.3390/life11121367.