来源：Biosensors (Basel) | 编译：DNA Lab Space
C反应蛋白（CRP）是临床上广泛使用的炎症和心血管风险标志物，其灵敏、快速检测对疾病诊断和预后判断具有重要意义。近期，研究人员利用天然羊驼纳米抗体文库，以噬菌体展示和酵母展示两种技术平行筛选，成功获得多个能够特异性识别CRP的纳米抗体结合物，为CRP新型免疫检测试剂的开发提供了可行的分子工具。该研究系统比较了两种展示系统在天然抗体库淘选中的性能，展示了不同筛选策略在抗体发现中的互补价值。
研究背景
CRP是机体急性期反应中由肝脏合成并释放至血液的蛋白质，正常人体内水平极低，但在感染、炎症、组织损伤和心血管疾病等病理状态下会急剧升高。因此，CRP被广泛用作炎症标志物，临床检测需求极大。目前常用的CRP检测方法多基于多克隆抗体或单克隆抗体，这些抗体虽然成熟，但存在批次差异大、生产成本较高、热稳定性有限等不足。纳米抗体又称VHH抗体，源自羊驼等骆驼科动物，仅由重链可变区组成，具有分子质量小、结构稳定、溶解性好、易于基因工程改造等优点，逐渐成为免疫检测和生物传感领域的理想识别元件。然而，获取高亲和力、高特异性的抗CRP纳米抗体，通常需要对羊驼进行免疫，这一过程耗时且难以应对天然库无法获得高识别能力的问题。因此，直接从天然纳米抗体文库中通过体外展示技术进行筛选，成为一种具有吸引力的替代方案。噬菌体展示和酵母展示是两种最常用的文库筛选平台：前者通量高、操作快速，后者具有真核蛋白折叠机制，能够保留抗体的天然构象和正确修饰。然而，二者在天然文库淘选中的实际效果如何差异、能否互补，尚缺少系统性认识。本研究以CRP为靶标，采用这两种展示系统对同一天然羊驼纳米抗体库进行平行淘选，旨在筛选出可实际用于CRP检测的纳米抗体，并评估不同筛选平台的优劣。
研究方法
研究首先从羊驼外周血淋巴细胞中提取总RNA，通过反转录扩增VHH基因片段，构建了天然纳米抗体噬菌体展示文库。这一天然文库未经免疫刺激，理论上可通过体外筛选获得针对任意靶标的特异性克隆。随后，研究者将重组CRP蛋白作为靶抗原固相包被于免疫管或微孔板中，使用噬菌体颗粒进行连续多轮“吸附–洗涤–洗脱–扩增”的淘选过程。每一轮淘选都严格增加去污剂浓度和洗涤次数，以提高结合特异性，回收的噬菌体用于感染大肠杆菌进行扩增，并计算富集倍数。
与噬菌体展示平行，研究者将同一VHH基因文库重组到酵母展示载体中，构建了酵母表面展示文库。酵母展示依赖Aga2p蛋白与细胞壁Aga1p通过二硫键共价连接，使外源VHH片段以融合蛋白形式表达于酵母细胞表面。针对CRP的筛选采用磁珠富集结合流式细胞分选策略：先将生物素化的CRP与链霉亲和素磁珠偶联，与酵母文库孵育后，通过磁性分离富集表面展示有CRP结合VHH的酵母细胞；随后用荧光标记的CRP和检测抗体对富集细胞进行染色，利用流式细胞仪进一步分选出与CRP结合信号最强的单细胞克隆。
经过噬菌体展示和酵母展示各自独立的筛选流程后，研究者分别挑取阳性克隆、提取质粒并测定VHH基因序列，用于分析序列多样性。随后，将编码候选VHH的基因亚克隆至细菌或酵母可溶性表达载体，通过诱导表达和亲和纯化获得重组纳米抗体蛋白。在蛋白水平上，研究者利用ELISA和生物层干涉技术等测定纳米抗体对CRP的亲和力与特异性。此外，为进一步验证其检测适用性，部分纳米抗体被构建为双价或Fc融合形式，并用于模拟血清环境中CRP的定量检测实验。技术路线包括文库构建、平行淘选、序列分析、蛋白表达与功能表征以及检测性能验证等环节，整体流程如下所示。
研究结果
在噬菌体展示淘选过程中，经过四轮富集，噬菌体回收率逐轮显著提升，表明CRP特异性的纳米抗体克隆得到有效富集。从淘选后的平板上随机挑取克隆进行噬菌体ELISA鉴定，获得数十个CRP阳性克隆。序列分析显示，这些阳性克隆可划分为多个独特的VHH家族，且部分克隆共享保守的框架区，互补决定区则表现出高度多样性，说明筛选结果具有较好的序列多样性。
酵母展示筛选方面，研究者通过MACS预富集和FACS单细胞分选，在第二代库中检测到明显的CRP结合阳性群体，随后经过两轮流式分选，最终获得单克隆酵母菌株。流式细胞术分析表明，这些单克隆酵母细胞表面展示的VHH能够以浓度依赖方式结合CRP，进一步用不同浓度CRP进行染色，可计算得到表观解离常数，多个候选克隆的亲和力处于纳摩尔至亚微摩尔范围，符合从天然文库中直接筛选获得的典型亲和力水平。
将候选VHH基因转入大肠杆菌表达后，获得可溶性重组蛋白。ELISA实验证实，纯化的纳米抗体能够与固定化CRP特异性结合，而人血清白蛋白等无关蛋白几乎没有信号，证明其具有良好的靶标特异性。值得注意的是，两种筛选平台获得的克隆集合有部分重叠，但也存在各自独有的克隆。酵母展示筛选得到的某些VHH在噬菌体展示筛选中未被发现，这提示两种方法的筛选偏好存在差异。进一步的功能实验显示，部分抗CRP纳米抗体在构建双价形式后，对CRP的检测灵敏度明显提高。在模拟临床血清基质中添加不同浓度CRP进行检测，所选双价纳米抗体能够建立稳定的标准曲线，线性范围覆盖临床关注的低、中、高水平CRP区间，检测限达到纳克/毫升级别，满足临床灵敏度要求。下图展示了关键筛选过程中阳性群体的流式分群和代表性纳米抗体的结合验证结果，以及不同筛选平台获得的克隆数量与序列多样性比较。
通过对比噬菌体展示和酵母展示的筛选效率，研究者发现噬菌体展示在操作速度和克隆通量方面具有明显优势，能够在较短时间内获得大量候选克隆；而酵母展示则提供了更接近真核表达环境的蛋白折叠和翻译后修饰，因此筛选到的克隆往往具有更天然的表面展示构象，在流式分析中呈现更集中的结合峰。两种方法综合使用可以覆盖更广泛的序列空间，为后续优化提供更多选择。下图展示了噬菌体展示与酵母展示在筛选结果上的具体差异，包括阳性率、独特序列数以及最终检出克隆的亲和力区间比较。
讨论与展望
本研究以CRP为模型靶标，系统展示了天然羊驼纳米抗体文库在噬菌体和酵母展示双平台上的平行淘选策略。结果表明，两种展示系统并非简单的替代关系，而是各有侧重、相互补充。噬菌体展示适合快速筛选和广度覆盖，但需要体内外多次扩增，容易丢失对细菌毒性或折叠不利的克隆；酵母展示则直接以真核细胞为展示平台，能够更好保留VHH天然构象，且通过流式分选可以实现定量、精细的亲和力区分。本研究获得的多株抗CRP纳米抗体不仅具备良好的特异性和亲和力，还通过简单基因工程实现二价化增强，显示出直接用于临床检测的潜力。
该研究的亮点在于完全采用天然文库，省去动物免疫过程，大大缩短了纳米抗体制备周期。同时，双平台平行筛选策略为其他靶标纳米抗体的开发提供了可复制