来源：蛋白纯化峰形差凝胶过滤、发酵产酶低溶氧控制、细胞克隆形成少血清批次、核酸测序峰弱模板质量、质谱重现性差进样针堵、蛋白表达降解快蛋白酶抑制（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑了一整天的柱子，峰还是拖尾；测序结果一打开，峰高不到100 RFU；质谱连续进六针，RSD飙到35%。方法没改，试剂没换，结果就是不稳。这类翻车九成不是玄学，是某个环节的物理或化学参数被悄悄改掉了。下面按凝胶过滤、发酵产酶、细胞克隆、测序、质谱、蛋白降解六条线，把现象、原理、动作、验证一次讲清。照做。先救命，再优化。
第一步：快速排查低级错误
1. 缓冲液没过滤。 配完直接上柱，盐粒和粉尘会把柱子堵出沟流。解决：0.22 μm滤膜过一遍，含盐缓冲液尤其别省。
2. 柱子平衡不到位。 只冲1个柱体积就上样，盐峰和蛋白峰直接叠在一起。解决：至少2 CV，Superdex 200 10/300就是48 mL，0.5 mL/min跑1.6 h。
3. 样品没离心就上机。 沉淀进柱子、进进样针，全是麻烦。解决：12000 g、4°C、10 min，只取上清。
4. 室温没记录。 22°C和4°C跑同一根柱，保留时间能差3-5%，出峰位置全乱。解决：柱温箱固定温度，写进实验记录。
第二步：分维度系统排查
1. 凝胶过滤峰形拖尾、出肩峰
现象：主峰前面鼓个肩，或者后拖得厉害，两个峰死活分不开，A280曲线毛毛糙糙。
原理：上样体积超过柱床体积的2%，分子走了捷径；柱床里有气泡或沟流也一样。
解决：上样体积压到500 μL以内（柱床24 mL的2%），样品先过0.22 μm；柱效不行就重装，装柱流速别超过厂商标称值的70%。
验证：打一针蓝色葡聚糖2000测柱效，理论塔板数掉30%以上，别犹豫，重装。
2. 发酵产酶低、溶氧掉底
现象：菌体长得挺好，酶活只有对照一半。诱导后5 min，DO从60%直接掉到5%。
原理：供氧跟不上，丙酮酸堆积产酸，pH跌破6.0