大肠杆菌异柠檬酸裂解酶乙酰化机制解析与理性工程改造提升生物

来源：The acetylation mechanism and engineering strategy of isocitrate lyase for optimizing biosynthesis in Escherichia coli（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

蛋白质赖氨酸乙酰化长期被视为调控细胞生理的普遍修饰，却鲜少被真正用于代谢工程。本研究系统解析了大肠杆菌乙醛酸支路关键酶——异柠檬酸裂解酶（AceA）的乙酰化机制：它同时受非酶促（乙酰磷酸）与酶促（YfiQ/CobB）双重调控，且乙酰化显著抑制酶活。作者据此设计出AceA(S335Q/S398Q)双突变体，酶活提升2.12倍，并在PG、3HP、乙醇酸合成中验证了增产效果。

研究背景

细胞生理受复杂调控网络支配，翻译后修饰（PTM）是其中精细的一环——通过共价化学反应改变氨基酸，提升蛋白质结构复杂度与调控精度。过去50年间已发现200余种蛋白修饰类型，包括磷酸化、泛素化、甲基化与乙酰化等。其中赖氨酸乙酰化高度保守，广泛影响基因表达、代谢与细胞稳态。赖氨酸乙酰化可由赖氨酸乙酰转移酶催化（酶促机制），也可由乙酰磷酸（AcP）直接化学修饰（非酶促机制）；两类修饰均可被组蛋白去乙酰化酶（HDACs）或sirtuins（SIRTs）逆转。乙酰化最初在组蛋白修饰与表观遗传调控中被认识，蛋白质组学的发展则揭示其在非组蛋白上的广泛存在，说明乙酰化深度参与多种生理与代谢过程。正因如此，赖氨酸乙酰化有望成为代谢工程的潜在工具：通过操控乙酰化水平，或构建不受乙酰化影响的酶，可开辟新的优化路径。但这一方向在代谢工程中的应用仍待深入探索。

研究方法

2.1 质粒与菌株构建

本研究所用全部质粒与菌株列于表S1。质粒构建采用标准分子生物学技术，包括PCR与限制性内切酶消化，宿主为大肠杆菌DH5α。蛋白表达与目标产物合成在大肠杆菌BL21(DE3)中进行。aceA的定点突变按Stratagene方案操作。大肠杆菌BL21(DE3)的染色体突变体通过CRISPR与P1 vir介导的转导构建。P1 vir介导转导所用的供体菌株来自Keio collection。

【数据】宿主菌：E. coli DH5α（克隆）、E. coli BL21(DE3)（表达）；突变方法：Stratagene定点突变方案、CRISPR、P1 vir转导；供体来源：Keio collection；原文未详述PCR条件与酶切参数

2.2 蛋白表达、纯化与稳定性分析

菌株在添加相应抗生素的LB培养基中培养。过夜培养物按1:50稀释至含2%葡萄糖的新鲜LB中，37 °C培养。当OD600约为0.6时，加入100 μM IPTG诱导蛋白表达，随后于30 °C继续培养18 h。收集细胞，重悬于PBS（pH 7.5），高压破碎。上清液按供应商方案用Ni-NTA His·Bind柱（Novagen）纯化。纯化蛋白用于乙酰化与活性测定。蛋白表达分析时，细胞培养至OD600约0.6，加入100 μM IPTG，30 °C培养，诱导后不同时间点取样。稳定性测试中，菌株在含2%葡萄糖的LB中培养，IPTG诱导4 h后加入氯霉素（200 μg/mL）处理不同时间。收集细胞、重悬于PBS，高压匀浆破碎。离心后收集含总细胞蛋白的上清，归一化蛋白浓度。样品经12% SDS-PAGE分离，用抗His抗体进行Western blot分析。

【数据】培养基：LB；接种稀释：1:50；碳源：2%葡萄糖；诱导温度：37 °C（生长）、30 °C（表达）；诱导剂：100 μM IPTG；诱导时长：18 h；OD600：0.6；破碎缓冲液：PBS pH 7.5；稳定性处理：氯霉素200 μg/mL、诱导后4 h；凝胶：12% SDS-PAGE；抗体：抗His

2.3 Western blotting

蛋白经12% SDS-PAGE分离后，于15 V、1.5 h转印至PVDF膜。用快速封闭液（Beyotime）封闭后，膜与抗乙酰赖氨酸小鼠单克隆抗体（EASYBIO，1:2000）于4 °C孵育过夜，随后与HRP标记的抗小鼠二抗（EASYBIO，1:10000）孵育。PBST洗涤后用增强化学发光（ECL）系统检测信号。

【数据】凝胶浓度：12% SDS-PAGE；转膜电压：15 V；转膜时间：1.5 h；一抗：抗乙酰赖氨酸小鼠单克隆抗体，1:2000，4 °C过夜；二抗：HRP抗小鼠，1:10000；检测：ECL；洗涤液：PBST

2.4 AceA活性测定

AceA活性按此前报道的类似方案测定。每个反应体系含50 mM MOPS（pH 6.8）、5 mM MgCl2、1 mM NADH、7单位乳酸脱氢酶、5 mM异柠檬酸。乙酰化位点模拟突变体的活性测定使用1 μM纯化AceA蛋白，其余活性测定使用0.4 μM。用Spark酶标仪（Tecan）在340 nm监测NADH氧化。

【数据】缓冲液：50 mM MOPS pH 6.8；MgCl2：5 mM；NADH：1 mM；乳酸脱氢酶：7 U；异柠檬酸：5 mM；酶量：突变体1 μM、其余0.4 μM；检测波长：340 nm；仪器：Tecan Spark酶标仪

2.5 体外乙酰化与去乙酰化

乙酰转移酶YfiQ介导的乙酰化与去乙酰化酶CobB介导的去乙酰化体外实验，按此前报道方案并作部分修改后进行。乙酰化反应体系含50 mM Tris–HCl（pH 7.8）、0.1 mM EDTA、10%甘油、1 mM二硫苏糖醇、10 mM丁酸钠、0.2 mM乙酰辅酶A、100 μg YfiQ与40 μg AceA，总体积200 μL，37 °C孵育1 h。去乙酰化酶反应体系含40 mM HEPES（pH 7.0）、6 mM MgCl2、1 mM NAD+、2 mM NAM+、1 mM二硫苏糖醇、10%甘油、100 μg CobB与40 μg AceA，终体积200 μL，37 °C孵育1 h。所有处理样品均进行Western blot与酶活分析。AcP介导的乙酰化实验中，50 μg AceA与不同浓度AcP混合，总体积100 μL，37 °C孵育不同时间。

【数据】乙酰化体系：50 mM Tris–HCl pH 7.8、0.1 mM EDTA、10%甘油、1 mM DTT、10 mM丁酸钠、0.2 mM乙酰辅酶A、100 μg YfiQ、40 μg AceA、200 μL、37 °C、1 h；去乙酰化体系：40 mM HEPES pH 7.0、6 mM MgCl2、1 mM NAD+、2 mM NAM+、1 mM DTT、10%甘油、100 μg CobB、40 μg AceA、200 μL、37 °C、1 h；AcP乙酰化：50 μg AceA、100 μL、37 °C、浓度与时间可变

2.6 摇瓶发酵与分析方法

摇瓶实验设三个平行，使用250 mL无挡板三角瓶，每瓶装50 mL发酵培养基。LB中37 °C过夜培养后，按1:50稀释至新鲜发酵培养基。当OD600约0.6时加入0.1 mM IPTG，30 °C继续培养。细胞生长用Hitachi U-2900分光光度计于600 nm测定吸光度定量。残余葡萄糖浓度用高效液相色谱（HPLC）测定，仪器为Agilent 1260 Infinity系列，配Bio-Rad HPX-87H柱（300 × 7.8 mm）。PG、3HP与乙醇酸的发酵及分析方法遵循此前建立的方案。胞内AcP浓度通过羟肟酸法形成乙酰羟肟酸铁，于505 nm测定。

【数据】摇瓶：250 mL无挡板三角瓶、装液50 mL、三平行；接种：1:50；诱导：OD600约0.6、0.1 mM IPTG、30 °C；生长检测：600 nm，Hitachi U-2900；HPLC：Agilent 1260 Infinity、Bio-Rad HPX-87H柱300 × 7.8 mm；AcP检测：505 nm羟肟酸法

研究结果

3.1 AceA可经非酶促与酶促机制被乙酰化

乙酰磷酸（AcP）是经磷酸转乙酰酶（Pta）与乙酸激酶（AckA）途径生成的代谢中间体，作为关键乙酰供体，通过非酶促机制直接乙酰化去质子化的赖氨酸ε-氨基。ackA突变体中胞内AcP水平升高，而pta突变则使AcP浓度相对野生型下降。为评估AcP在体内AceA乙酰化中的作用，我们构建了Δpta、ΔackA及其对应的双突变株，并用抗乙酰赖氨酸单克隆抗体分析其乙酰化谱。与AcP可利用性一致，AceA乙酰化在Δpta与ΔptaΔackA突变体中明显降低，而在ΔackA背景中升高（图1B）。进一步的体外实验中，纯化AceA与递增浓度AcP孵育不同时间，乙酰化呈剂量与时间依赖性（图1C、D）。

大肠杆菌中已鉴定出一种赖氨酸乙酰转移酶YfiQ，属GCN5样乙酰转移酶（GNAT）家族。事实上，一种类似的酶Pat最早在肠道沙门氏菌中发现并表征。该乙酰转移酶可将乙酰基从供体乙酰辅酶A转移至靶蛋白赖氨酸残基的ε-氨基。在大肠杆菌中，NAD依赖的去乙酰化酶CobB是主要的赖氨酸去乙酰化酶，无论乙酰基来源是酶促还是非酶促，均能将其去除。为研究AceA的乙酰化机制及其在体内的潜在可逆性，我们同样用抗乙酰赖氨酸单克隆抗体进行Western blot分析。首先在体内与体外评估YfiQ与CobB对AceA乙酰化修饰的作用。我们构建了大肠杆菌yfiQ与cobB敲除突变体，并将AceA过表达质粒分别转入这些突变体。与野生型相比，AceA乙酰化水平在ΔyfiQ菌株中下降、在ΔcobB菌株中升高（图2A）。随后纯化YfiQ与CobB，分别与AceA体外孵育。AceA乙酰化在与乙酰辅酶A孵育后增强，与乙酰辅酶A和YfiQ共同孵育后进一步增强（图2B）。Western blot表明，AceA乙酰化既可由YfiQ催化的酶促方式发生，也可由乙酰辅酶A非酶促发生（图2B）。此外，与NAD+依赖去乙酰化酶CobB孵育后，AceA乙酰化水平显著降低；加入烟酰胺（NAM，CobB的已知竞争性抑制剂）可抑制该去乙酰化反应（图2C）。综上，我们的发现证明大肠杆菌代谢酶AceA同时受非酶促与酶促乙酰化修饰。我们提供了该修饰可被sirtuin样去乙酰化酶CobB催化逆转的证据（图2D）。

这种动态可逆修饰使AceA处于双模式乙酰化控制之下。该机制凸显了AceA在翻译后水平调控的关键生理意义，使细胞能通过调节其活性适应多种代谢状态。需要指出，大肠杆菌中乙酰化的可逆性此前仅在少数实例中得到证明。这一观察暗示，可逆乙酰化很可能是受精确调控、具有关键生理作用的过程，而非广泛而无差别的现象。另一种可能是，负责逆转这些CobB不敏感底物乙酰化的特定去乙酰化酶尚未被鉴定。因此，寻找新去乙酰化酶的研究持续进行。例如，丝氨酸水解酶YcgC最初被提为候选，但后续研究未能证实其去乙酰化活性。在耻垢分枝杆菌中，蛋白MSMEG_4620已被报道具有去乙酰化活性，提示细菌中非sirtuin去乙酰化酶具有进化保守性。尽管如此，该领域在确证与表征新去乙酰化酶方面仍面临挑战。

【数据】菌株：Δpta、ΔackA、ΔptaΔackA、ΔyfiQ、ΔcobB；乙酰化变化：Δpta与ΔptaΔackA降低、ΔackA升高、ΔyfiQ降低、ΔcobB升高；体外AcP：剂量与时间依赖性；YfiQ体系：乙酰辅酶A增强、加YfiQ进一步增强；CobB体系：NAD+依赖去乙酰化、NAM抑制；抗体：抗乙酰赖氨酸单克隆抗体

3.2 碳源影响AceA的乙酰化状态

微生物发酵中碳源选择通过调节代谢流与能量生成，对细胞生长和产物合成产生关键影响。碳源类型还可影响细胞乙酰化组，改变乙酰辅酶A与乙酰磷酸等关键代谢前体的胞内池。理解碳源依赖的乙酰化动态，或可提供新策略：无需遗传干预，仅通过翻译后调控优化发酵过程、增强目标产物合成并减少副产物生成。为研究碳源对AceA乙酰化的影响，我们从添加不同浓度葡萄糖或甘油的LB培养基中纯化AceA，用Western blot评估乙酰化水平。补充葡萄糖或甘油后AceA乙酰化水平升高，呈明显剂量依赖性，且等浓度下葡萄糖诱导的乙酰化高于甘油（图3A、B）。然而，葡萄糖从1%提高到2%并未进一步增强乙酰化（图3B）。1%葡萄糖可能已足以诱导AceA最大乙酰化，2%浓度下未见进一步升高。

需注意，并非所有碳源在相同浓度下都会导致蛋白乙酰化水平差异。在相同浓度木糖与葡萄糖中生长的细胞，乙酰化水平相似（Schilling等，2019）。Schilling等提出，碳源对赖氨酸乙酰化的影响可能源于下游代谢物的变化，而非碳源身份本身。为探究不同碳源影响AceA乙酰化的机制，我们分别删除yfiQ与pta-ackA基因，构建酶促与非酶促乙酰化途径缺陷的突变株。在含1%甘油或1%葡萄糖的LB中培养野生型与突变株，评估AceA乙酰化状态。yfiQ突变体对两种碳源的乙酰化响应与野生型非常相似（图3C）。相反，AcP合成缺陷的pta-ackA双敲除株在补充葡萄糖或甘油后，AceA乙酰化均未显著升高（图3C）。这与先前研究一致：pta突变体补充葡萄糖后乙酰化水平不升高。此外，我们比较了两种突变体与野生株在相同培养条件下AcP与乙酸的浓度。yfiQ突变体在相同碳源下AcP与乙酸水平与野生株相近；而pta-ackA双敲除突变体的AcP与乙酸浓度明显低于野生型与yfiQ突变体（图3D）。而且，AceA乙酰化的碳源依赖性变化与两株菌中AcP和乙酸浓度呈正相关（图3C、D）。这些结果表明，乙酰转移酶YfiQ不负责AceA的碳源依赖性乙酰化；该过程似乎主要依赖糖酵解通量及随后积累的代谢物。

【数据】培养基：LB + 不同浓度甘油或葡萄糖；葡萄糖梯度：1%、2%；甘油：等浓度对比；菌株：野生型、ΔyfiQ、Δpta-ackA；乙酰化：葡萄糖>甘油（等浓度）、1%葡萄糖达最大、2%无进一步升高；ΔyfiQ响应类似野生型；Δpta-ackA补充碳源后无显著升高；AcP与乙酸：Δpta-ackA明显低于野生型与ΔyfiQ；检测：Western blot、505 nm羟肟酸法

3.3 特定位点乙酰化对AceA酶活的功能作用

（原文节选至此，后续结构分析、定点突变、AceA(S335Q/S398Q)双突变体构建（酶活提升2.12倍）及PG、3HP、乙醇酸产量验证等内容未在本次节选中提供，故不展开。）

讨论与解读

乙醛酸支路是关键的补回途径，绕过TCA循环的脱羧步骤，实现乙酸高效同化与碳骨架节约。异柠檬酸裂解酶（AceA）催化该支路关键步骤，其调控对重定向中心碳流至关重要。本研究系统表征了大肠杆菌AceA的赖氨酸乙酰化机制，证明其对酶活的抑制作用；据此开发乙酰化介导的理性设计策略，构建AceA(S335Q/S398Q)双突变体，活性与稳定性显著提升；工程酶在PG、3HP与乙醇酸多种化学品合成中验证有效。研究确立了AceA乙酰化理性调控作为优化乙醛酸支路的有效策略，可提升微生物合成中的碳转化效率与生物产量，为利用翻译后修饰见解理性改造代谢提供了新范式。

编译者解读：该工作把"修饰位点"当作可编程的调控旋钮，而非单纯的表型描述——用乙酰化模拟突变（S→Q）绕过复杂的乙酰化酶调控网络，直接锁定酶活提升，思路干净。2.12倍酶活与多产物验证说明其工程可迁移性。局限在于：Q突变仅模拟乙酰化电荷效应，未必复现真实乙酰化动态；且增产幅度依赖宿主背景与途径通量匹配，工业规模下的稳定性仍待检验。

参考来源

Jia R. The acetylation mechanism and engineering strategy of isocitrate lyase for optimizing biosynthesis in Escherichia coli. Synthetic and Systems Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.031

DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.031