来源：Metabolic engineering of Pseudomonas taiwanensis for heterologous production of myxochelin A（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黏球菌素A是一种儿茶酚型铁载体，可抑制人5-脂氧合酶，具有抗炎与抗肿瘤潜力，但天然产量极低。本研究在稳健宿主台湾假单胞菌VLB120中建立其异源合成，从0.6 mg/L起步，经模块筛选、碳源共喂、基因过表达与前体补加，产量提升逾300倍至226.4 mg/L，并揭示了产物向结构类似物azotochelin转化的机制。
研究背景
天然产物及其衍生物在医药与农业领域日益受到关注。黏球菌素类铁载体由黄色黏球菌、橙色标桩菌等黏细菌产生，其功能是帮助细胞在竞争性微生物环境中摄取铁。铁载体的铁螯合特性赋予其多种生物技术用途——可络合环境中的有毒重金属，或在农业中保护植物免受病原菌侵染、促进生长。黏球菌素A及其衍生物还被报道能强烈抑制人5-脂氧合酶，该酶是白三烯生物合成的核心，调控炎症与过敏反应，因此黏球菌素在体外表现出抗肿瘤与抗转移活性，黏球菌素A还可抑制鼠源癌细胞侵袭。黏球菌素A经非核糖体肽合成途径、由前体2,3-二羟基苯甲酸和赖氨酸缩合而成。天然产生菌产量低，限制了其应用开发，异源高产因此成为可行路线。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
固氮菌（Azotobacter vinelandii）在30°C下培养，使用固氮菌培养基，含5 g/L葡萄糖、5 g/L甘露醇、0.1 g/L CaCl₂·2H₂O、0.1 g/L MgSO₄·7H₂O、5 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.9 g/L K₂HPO₄、0.1 g/L KH₂PO₄、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O和5 g/L CaCO₃。固体培养基另加15 g/L琼脂。台湾假单胞菌VLB120与大肠杆菌分别于30°C和37°C培养。溶菌肉汤（LB）培养基含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L氯化钠，适用时加15 g/L琼脂（Carl Roth）。LB培养基用于克隆操作，以及由冷冻菌种或琼脂平板接种的初始预培养，供后续生产实验使用。克隆操作、预培养或携带质粒菌株的主培养中，分别向相应培养基补加终浓度50 mg/L卡那霉素硫酸盐（Carl Roth）、100 mg/L氨苄青霉素钠盐（Carl Roth）、10 mg/L（液体）至25 mg/L（固体）庆大霉素（Carl Roth）和30 mg/L四环素盐酸盐（Carl Roth）以维持选择压力。培养大肠杆菌时，庆大霉素浓度降至10 mg/L。平板接合后，向培养基中加入终浓度25 mg/L Irgasan（Sigma Aldrich）以筛选假单胞菌。所用矿质盐培养基（MSM）改编自Hartmans等，含44.6 mM K₂HPO₄与27.2 mM NaH₂PO₄的磷酸缓冲容量、2 g/L (NH₄)₂SO₄，以及包括18 µM FeSO₄在内的微量元素。按不同浓度补加D-(+)-葡萄糖一水合物（Carl Roth）、甘油（Carl Roth）、柠檬酸（Carl Roth）、琥珀酸（Thermo Scientific）、乙酸钾（Sigma-Aldrich）或辛酸钠（Sigma-Aldrich）作为碳源。诱导nagR/PnagAa启动子系统时，向培养基中加入0.1 mM水杨酸钠（≥99.0%，Sigma-Aldrich）。2,3-二羟基苯甲酸（Sigma Aldrich）按各实验所示补加。培养基组成与遗传背景的最优筛选在System Duetz 24孔微孔板（CR1424a，EnzyScreen）中进行小规模培养，每孔装1.5 mL培养基，用三明治盖（CR1224b，EnzyScreen）密封。以葡萄糖为主培养碳源时，预培养以20 mM葡萄糖为唯一碳源。为使细胞适应甘油并缩短延滞期，相应预培养含40 mM甘油并联合2 mM葡萄糖。所有台湾假单胞菌主培养接种至OD600 0.05。为在有限培养体积下实现随时间多次取样，平行培养多组。据此，先将10 mL培养基接种，再分装至多个微孔板。System Duetz板以300 rpm、50 mm振幅振荡。为表征生产过程，将表现最佳的菌株在2 L DASGIP生物反应器（Eppendorf）中培养，装液1000 mL双倍缓冲MSM。主培养自40 mM甘油加2 mM葡萄糖的预培养接种至OD600 0.05。初始搅拌转速设为400 rpm，初始通气率60 sL/h。溶氧张力设定为30%，通过搅拌级联控制：第一级搅拌400–800 rpm（DOT控制器输出0–40%）；第二级气流1–2 vvm（输出40–80%）；第三级氧含量21–100%（输出80–100%）。pH设为7，通过加入2 M NaOH与2 M H₂SO₄控制。每3 h用Numera自动取样器（Securecell）取样。未过滤样品经2 × 4 mm硅胶管（VWR，228–0704）抽取，注入密闭的1.5 mL样品管（Carl Roth，NN01.1 + ND10），4°C保存至后续处理。随后，管内残留培养液冲回生物反应器。不同反应器顺序取样之间，装置用0.1 M NaOH、70%乙醇和水清洗。为考察底盘菌株pyoverdine产量的上下限，台湾假单胞菌VLB120 GRC3在BioLector XT（Beckman Coulter）中用Flowerplate培养36 h，装液1 mL。MSM预培养自LB预培养接种至OD600 0.1。主培养接种至OD600 0.1。细胞在缺铁（0 µM FeSO₄）、中等（18 µM FeSO₄）与充足（38 µM FeSO₄）铁浓度下生长，或在中等FeSO₄浓度下补加200 mg/L黏球菌素A或308 mg/L 2,3-二羟基苯甲酸。Flowerplate以1200 rpm振荡。
【数据】菌株：A. vinelandii、P. taiwanensis VLB120、E. coli；温度：30°C（A. vinelandii、P. taiwanensis）、37°C（E. coli）；葡萄糖：5 g/L（固氮菌培养基）、20/30 mM（主培养）；甘露醇：5 g/L；CaCl₂·2H₂O：0.1 g/L；MgSO₄·7H₂O：0.1 g/L；Na₂MoO₄·2H₂O：5 mg/L；K₂HPO₄：0.9 g/L（固氮菌）、44.6 mM（MSM）；KH₂PO₄：0.1 g/L；FeSO₄·7H₂O：0.01 g/L；CaCO₃：5 g/L；琼脂：15 g/L；胰蛋白胨：10 g/L；酵母提取物：5 g/L；NaCl：5 g/L；卡那霉素：50 mg/L；氨苄青霉素：100 mg/L；庆大霉素：10–25 mg/L（大肠杆菌10 mg/L）；四环素：30 mg/L；Irgasan：25 mg/L；(NH₄)₂SO₄：2 g/L；FeSO₄：18 µM（MSM）、0/18/38 µM（铁梯度实验）；水杨酸钠：0.1 mM；甘油：40 mM；微孔板装液：1.5 mL；接种OD600：0.05；振荡：300 rpm、50 mm振幅；生物反应器：2 L、装液1000 mL；搅拌：400 rpm起始、400–800 rpm级联；通气：60 sL/h起始、1–2 vvm；DOT：30%；pH：7；取样间隔：3 h；Flowerplate振荡：1200 rpm；培养时间：36 h
2.2 质粒克隆与菌株构建
克隆用引物（表S1）、诊断PCR与测序引物由Eurofins genomics以未修饰寡核苷酸形式订购。基因片段扩增用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix（New England Biolabs），诊断PCR用OneTaq Quick-Load 2X Master Mix with Standard Buffer（New England Biolabs）。模板菌落按Chomczynski与Rymaszewski方法用碱性PEG 200预裂解。所用质粒见表S2，本研究构建者的克隆细节见表S3。DNA片段用NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs）按厂商方案组装，随后转化化学感受态大肠杆菌PIR2或DH5α。质粒提取用Monarch® Plasmid Miniprep Kit（New England Biolabs）。mxcG的密码子优化按Wynands等所述用OPTIMIZER在线工具完成。缺失/整合质粒通过接合递送。为此，将大肠杆菌供体、假单胞菌受体与辅助菌株大肠杆菌HB101 pRK2013进行平板混合。向平板接合中加入提供反式转座酶的大肠杆菌DH5α λpir pTNS1，实现向受体attTn7位点的染色体整合。递送不带oriT的pJNNopt衍生质粒时，按Choi等方案进行电转化。本研究所构建与使用的菌株见表S4。
【数据】质粒：pJNNopt系列、pBG14f_FRT_Kan、pRK2013、pTNS1；抗生素：卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、四环素（浓度见2.1）；菌株：E. coli PIR2、DH5α、HB101、DH5α λpir；整合位点：attTn7；原文未详述PCR程序参数
2.3 分析方法
细胞培养物光密度于600 nm（OD600）用Ultrospec 10光度计（Biochrom）测定。取出的培养样品经离心、过滤，−20°C保存，随后在配备1260 DAD WR与1260 RID的1260 Infinity II HPLC系统（Agilent Technologies）上分析。碳源定量使用Metab-AAC柱（300 × 7.8 mm，ISERA；P.N.: A1BF-A1AA0N），配Guard Cartridge Holder（ISERA，P.N.: AA13-000005）与保护柱（10 × 7.8 mm，ISERA；A1BF-A1AG0N）。分析物用5 mM H₂SO₄等度洗脱20 min，流速0.6 mL/min，温度60°C。辛酸定量及早期黏球菌素A与2,3-二羟基苯甲酸分析（图2数据）使用InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱（3.0 × 150 mm，2.7 μm，Agilent Technologies，P.N. 693975-02 T）配保护柱（Agilent Technologies；P.N.: 823750-911），按表S5所述梯度洗脱。后续方法开发中，黏球菌素A、azotochelin与2,3-二羟基苯甲酸的定量改用EC 100/2 Nucleoshell PFP柱（Macherey-Nagel REF 763534.20），配Column Protection System（Macherey-Nagel REF 718966）与保护柱（Macherey-Nagel REF 763538.20），40°C、按表S6梯度洗脱。此配置下，过滤样品进样前酸化至终浓度1%甲酸，促使黏球菌素A与azotochelin从铁上解离。
【数据】检测波长：600 nm（OD600）；色谱柱：Metab-AAC 300 × 7.8 mm、Poroshell 120 EC-C18 3.0 × 150 mm/2.7 μm、Nucleoshell PFP EC 100/2；洗脱液：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：60°C（碳源）、40°C（黏球菌素/azotochelin）；洗脱时间：20 min（等度）；甲酸终浓度：1%；样品保存：−20°C；原文未详述表S5/S6梯度具体参数
研究结果
3.1 黏球菌素生产模块的筛选
黏球菌素的生产较为黏细菌所特有，但其前体2,3-二羟基苯甲酸与赖氨酸的合成在微生物中广泛存在。枯草芽孢杆菌的bacillibactin、大肠杆菌的enterobactin等非核糖体天然产物同样源自2,3-二羟基苯甲酸，可提供潜在的替代生产模块。为确保前体2,3-二羟基苯甲酸的充足供应，选择进入莽草酸途径通量提高的台湾假单胞菌GRC3Δ6-TYR1作为生产宿主。该菌株中实施了六个缺失（pobA、hpd、quiC、quiC1、quiC2和benABCD），通过阻断降解途径减少前体与产物损失。pykA的缺失以及TrpE（P290S）与AroF-1（P148L）的单氨基酸替换，使碳通量更多流向莽草酸途径以合成芳香化合物。此前有报道称，在该台湾假单胞菌底盘中进行异源生产时，2,3-二羟基苯甲酸产量因所用生产模块不同而存在显著差异。在此背景下，来自黄色黏球菌的mxcCDF-mtaA基因仅能实现可忽略的2,3-二羟基苯甲酸产量，而基于大肠杆菌来源基因的两个模块获得了更高滴度。因此，分别用EntC或MenF替换MxcD，同时用EntA替换MxcC。由于MxcF也是2,3-二羟基苯甲酸腺苷化所必需，故未替换，而是通过在生产模块中额外整合异分支酸酶EntB加以补充。相应基因被克隆入mini-Tn7递送载体pBG14f_FRT_Kan，以定向整合至染色体Tn7附着位点（attTn7）。该载体带有强组成型启动子（P14f）与BCD2元件，可可靠地过表达基因。除编码黏球菌素A生物合成的基因外，菌株还装备了编码相应外排泵的mxcK。为避免副产物黏球菌素B的形成，生产模块中排除了mxcL。生产实验前，通过耐受性测试进一步确认所得生产菌株的适用性。为此，将黏球菌素A以接近天然生产报道的浓度加入基础培养基（图S1）。在黏球菌素A存在下观察到的生长表明，台湾假单胞菌能够应对该儿茶酚及其相关螯合效应。黏球菌素A另一前体赖氨酸的可用性，通过缺失davB来评估，从而中断台湾假单胞菌的赖氨酸降解途径。所有菌株还携带质粒pJNNopt-mtaA，用于水杨酸诱导（nagR/PnagAa）过表达mtaA，确保MxcF与MxcG的高效翻译后修饰。所得菌株在20与30 mM葡萄糖上生长并筛选性能（图2，表S7）。
由于黏球菌素合成是相当耗能的途径，加入甲酸作为供能共底物。模块attTn7::P14f-mxcCDEFGK_mtaA最初实现0.6 ± 0.0 mg/L黏球菌素A产量。在mtaA上游整合额外合成启动子（P14c）未显著影响产量（p > 0.05），表明该菌株中MxcF与MxcG的翻译后激活并非瓶颈。所有其他旨在提高前体供应的尝试均导致黏球菌素A产量下降，attTn7::P14f-menF-entBA-mxcCDEFGK_mtaA甚至降至仅0.2 ± 0.0 mg/L。由于这些替代2,3-二羟基苯甲酸模块此前曾带来产量提升，此时前体供应似乎并非限制因素。前体向黏球菌素A的转化是高度耗能的途径。然而，提高葡萄糖供应（30而非20 mM）作为碳源与能源并未显著（p > 0.05）提升产量（≤0.7 ± 0.1 mg/L）。我们因此推测，限制在于基因表达不足，而非能量或碳源供应。据此，后续生产实验停止补加甲酸。在此背景下，生产宿主遗传背景由酪氨酸过产的GRC3Δ6-TYR1改为改造较少、生长更快的GRC3Δ6菌株，因为2,3-二羟基苯甲酸产量并非限制因素。此举旨在通过降低与芳香化合物从头合成升高相关的代谢负担，提高稳健性与基因表达。由于似乎限制的是mxc基因而非mtaA的表达水平，后续实验不再使用pJNNopt-mtaA。生产模块初始设计中，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合酶AroAA5被从基因簇中移除，因为先前所用生产宿主（GRC3Δ6-TYR1）中已存在抗反馈抑制的同源物（AroF-1P148L）。然而，众所周知基因表达可受多种因素影响，包括基因组背景，尤其对大型生物合成操纵子而言，RNA稳定性可影响异源生产模块。首批实验中，mxcC与mxcD被大肠杆菌功能相似基因替换的菌株产量较低。但遗传背景产生的非平凡极性效应可能影响基因表达。因此，为检验mxc基因簇的完整性是否有利于黏球菌素A生产，将按原始顺序mxcCDEFG_aroAA5_mxcK组合mtaA的完整基因簇与先前生产模块attTn7::P14f-mxcCDEFGK-P14c-mtaA进行比较（图3，表S7）。对同一菌株平行培养的多个样品随时间取样。此实验期间，我们观察到另一种此前未检出化合物的形成与积累。这很可能与两次实验之间为优化检测与定量而改动了HPLC分析有关。因此，该化合物很可能存在于先前样品中，只是因分析限制未被检出。产物稳定性测试显示，外源补加的黏球菌素在非生物生产条件下（图3A）或在不含黏球菌素A生物合成模块的亲本菌株培养中（图3B）均无任何不稳定。然而，所有测试生产菌株中黏球菌素A浓度在24 h后下降（图3D-F）。与非生物对照和亲本菌株相反，生产菌株中黏球菌素A在24 h后因从头合成出现瞬时峰值浓度后即下降（图3C）。仅在该培养中形成了第二种产物。起初，该额外产物与黏球菌素A同时形成，但从头合成黏球菌素A结束之后，该产物继续形成，而黏球菌素A浓度下降。这表明途径酶参与了黏球菌素A向类似化合物的转化。我们推测该相关化合物为azotochelin（图1），由固氮菌天然产生。由于无法获得azotochelin的真实标准品，我们培养固氮菌OP，并将其上清与生产菌株上清比较。依据Baars等的报道，固氮菌在充足铁供应（36 µM FeSO₄）下培养。果然，该培养中检出一个峰，其保留时间与紫外-可见光谱与生产菌株培养中未知峰相同（图S2），表明该未知……
【数据】菌株：GRC3Δ6-TYR1、GRC3Δ6、GRC3Δ6 attTn7::P14f-mxcCDEFGK-P14c-mtaA；缺失基因：pobA、hpd、quiC、quiC1、quiC2、benABCD、pykA、davB；点突变：TrpE P290S、AroF-1 P148L；葡萄糖：20/30 mM；黏球菌素A产量：0.6 ± 0.0 mg/L（初始模块）、0.2 ± 0.0 mg/L（menF-entBA模块）、≤0.7 ± 0.1 mg/L（30 mM葡萄糖）；统计显著性：p > 0.05；甲酸：作为供能共底物（原文未详述浓度）；固氮菌铁浓度：36 µM FeSO₄；取样时间点：24 h；诱导剂：水杨酸（0.1 mM，见2.1）
3.2 黏球菌素A向azotochelin的转化及随时间变化的产量
3.3 不同碳源供应对从头合成黏球菌素A与azotochelin的影响
3.4 额外过表达mxcGopt与mxcEF对黏球菌素A和azotochelin产量的影响
3.5 补加2,3-二羟基苯甲酸对产量的提升及补料分批发酵
讨论与解读
本研究在台湾假单胞菌VLB120中成功建立黏球菌素A的异源生产，通过菌株与培养基优化及培养规模放大至罐式发酵器，产量由0.6 mg/L逐步提升至226.4 ± 1.3 mg/L。该产量显著超过橙色标桩菌等天然产生菌，且优势在于使用了确定成分的矿质培养基。由于出现前体限制，后续聚焦提高2,3-二羟基苯甲酸从头合成的策略可能有利，尽管也可能对生物转化产生负面影响。为此，menF-entBA或其他2,3-二羟基苯甲酸生产模块可从独立位点额外过表达，而不打断黏球菌素A生产模块的完整性。此外，将水杨酸诱导的nagR/PnagAa替换为组成型启动子可摆脱对水杨酸的依赖——否则水杨酸可能被掺入而替代2,3-二羟基苯甲酸。除黏球菌素A外，还检出经间接鉴定为azotochelin的副产物，其很可能由宿主天然醛氧化酶作用于黏球菌素A合成中的醛中间体衍生而来。进一步鉴定与表征相关酶有助于优化生产。
编译者解读：该工作示范了"底盘选择—模块比较—副反应追踪—前体补加"的经典代谢工程闭环。以产量为导向的逐级优化固然有效，但azotochelin的意外生成提示：异源途径与宿主天然酶系（醛氧化酶）的交叉反应会持续分流产物，仅靠补前体难以根治。若能在合成生物学层面敲除相关醛氧化酶或重构释放机制，产物专一性与碳得率仍有提升空间；同时，产量对培养时间的敏感性也提醒下游工艺需匹配快速分离。
参考来源
期刊：New Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.09.005
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.09.005