来源：Engineering Saccharomyces cerevisiae to express epoxycarotenoid dioxygenase for bioconversion of 4-vinyl guaiacol to vanillin and metabolites analysis（Innovative Food Science & Emerging Technologies）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
精酿啤酒风味不稳定，酚类异味（POF）是主要痛点之一。本研究从10株商业啤酒酵母中筛选出4-乙烯基愈创木酚（4VG）生成潜力最高的酿酒酵母645，导入编码9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶的SeNCED基因，构建了将异味前体4VG转化为高值香料香兰素的代谢路径。转化子No. 26在48 h香兰素产量达62.1 mg/g DCW，并在实际啤酒酿造试验中显著优于野生型。研究同时建立了GC与GC–MS挥发性风味代谢物分析流程。
研究背景
啤酒工业规模庞大——2024年全球市场估值8502亿美元，2023年美国市场约1170亿美元，其中精酿啤酒占总销售额24.7%。然而经过十年高速扩张，精酿市场趋于饱和，品牌差异化与创新风味成为竞争关键。疫情、通胀与气候变化推高原料成本，价格结构波动加剧。小批量酿造不同于工业规模生产，发酵常不一致、原料需求难以预测，风味稳定性受损，市场接受度受限。
啤酒含1000至2000种化合物，香气来自麦芽、酒花、酵母代谢、发酵条件与后熟的共同贡献。顶空固相微萃取/气相色谱–质谱（HS-SPME/GC–MS）比较研究显示，拉格、艾尔与酸啤的挥发性轮廓各异。消费者偏好与接受度深受发酵来源香气化合物影响，而这些化合物多由酿酒酵母在酿造过程中产生。部分菌株通过PAD1/FDC1介导的阿魏酸脱羧反应生成酚类异味，尤以4VG为代表。本研究提出一条基于酵母的转化策略：把不受欢迎的4VG转为香兰素——一种在食品、医药与工业领域均有应用的高值香气成分。
研究方法
2.1 菌株来源
编号007、029、534、588、644、645、1318、1968、3068与T-58的酵母菌株购自商业啤酒酵母，详见表1。大肠杆菌JM109与DH5α（Yeastern Biotech，台湾）用于质粒保存、测序与构建。
【数据】菌株：酵母007、029、534、588、644、645、1318、1968、3068、T-58；大肠杆菌：JM109、DH5α；试剂来源：Yeastern Biotech（台湾）；原文未详述其他参数
2.2 酵母培养与形态观察
十株酵母（表1）培养于YPD琼脂平板，含1%酵母提取物（Cyrus Bioscience，台湾）、2%蛋白胨（Protech Technology Enterprise Co., LTD.，台湾）、2%葡萄糖（SHOWA，Echo Chemical Co., LTD.，台湾）与1.5%琼脂（Cyrus Bioscience，台湾）。菌落形态与细胞大小在光学显微镜（CX21，Olympus，日本）下观察。细胞密度以分光光度计（GeneQuant 1300，Biochrom，英国）测定OD600。生长曲线分析的接种量调整为100 mL YPD中OD600 0.05，每小时测定OD600与细胞活力（CFU/mL），持续24 h，以计算世代时间（Stephenson, 2010; Xu et al., 2014）。
【数据】培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.5%琼脂）；接种OD600：0.05；体积：100 mL；监测频率：每小时；时长：24 h；仪器：CX21显微镜、GeneQuant 1300分光光度计
2.3 酵母鉴定与酚类异味基因检测
扩增内转录间隔区片段以鉴定各酵母物种（Ueno et al., 2019）。PCR使用引物对ITS1-F/ITS4-R和/或NS7-F/ITS4-R（表2）（Toju et al., 2012），在LabCycler 96（SensoQuest，德国）上进行。PCR产物连接至TA载体（Yeastern Biotech，台湾）并转化大肠杆菌JM109。质粒用Plasmid Miniprep Kit（ARROWTEC，台湾）提取，由Genomics（台湾）测序。序列经BLAST比对NCBI数据库分析。酵母中POF相关基因PAD1与FDC1的存在以基因特异性引物PAD1-F/PAD1-R与FDC1-F/FDC1-R（表2）经PCR评估。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。
【数据】引物：ITS1-F/ITS4-R、NS7-F/ITS4-R、PAD1-F/PAD1-R、FDC1-F/FDC1-R；PCR仪：LabCycler 96；载体：TA vector；宿主：E. coli JM109；测序服务：Genomics（台湾）；原文未详述PCR循环参数
2.4 酵母转化子构建
催化POF化合物4VG转化为香兰素的香兰素转化基因SeNCED参考Tang等（Tang et al., 2018）。基因序列针对酿酒酵母进行密码子优化，由OmicsBio（台湾）合成。合成SeNCED经KpnI酶切，连接至GAL1启动子控制下的pYES2表达载体，生成pYES2-SeNCED构建体。KanMAX选择标记盒从pKlac2-α-Kan质粒扩增，经NheI酶切连接至pYES2-SeNCED，生成用于香兰素生物合成途径工程的pYES2-SeNCED-G418。pYES2-SeNCED-G418按Simon与McEntee方法（Simon & McEntee, 1989）并参照Huang等（Huang et al., 2024）的修改，电穿孔导入酿酒酵母感受态细胞。电穿孔后，细胞涂布于补充200 μg/mL G418（Cyrus Bioscience，台湾）的YPG琼脂，30 °C培养至菌落形成。SeNCED的存在经PCR及琼脂糖凝胶电泳确认。
【数据】基因：SeNCED；载体：pYES2；启动子：GAL1；酶切位点：KpnI、NheI；选择标记：KanMAX；抗生素：G418 200 μg/mL；培养基：YPG琼脂；温度：30 °C；电穿孔方法：Simon & McEntee（1989）经Huang et al.（2024）修改
2.5 定量PCR（qPCR）检测SeNCED基因表达
野生型与转化酿酒酵母菌株培养于5 mL YPD或YPG（10 g/L酵母提取物[Cyrus Bioscience，台湾]；20 g/L蛋白胨[Protech Technology Enterprise Co., LTD.，台湾]；2%葡萄糖或半乳糖[SHOWA，Echo Chemical Co., LTD.，台湾]），补充200 μg/mL G418，30 °C。培养物于12、24、48与72 h收获。总RNA用NucleoSpin RNA Kit（Macherey-Nagel，德国）按厂商说明提取，RNA样品存于−80 °C。第一链cDNA用SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System Kit（Thermo Fisher Scientific，美国）合成。所得cDNA存于−20 °C备用。qPCR在96孔板（MB-Q96-S，Gunster Biotech，台湾）中进行，使用50 ng/μL cDNA与靶向SeNCED的基因特异性引物（表2）。管家基因TAF10（Teste et al., 2009）作为内参。反应在qPCR系统（Biometra, 846–070-000，德国）上按下述热循环条件进行（Teste et al., 2009）：95 °C初始变性10 min，随后45个循环的95 °C变性15 s与60 °C退火60 s。相对基因表达用2^–ΔΔCt法计算（Livak & Schmittgen, 2001），其中ΔΔCt = ΔCt（处理）– ΔCt（未处理），ΔCt = Ct（样品）– Ct（TAF10）。
【数据】培养体积：5 mL；培养基：YPD或YPG（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、2%葡萄糖或半乳糖）；G418：200 μg/mL；温度：30 °C；取样时间：12、24、48、72 h；cDNA用量：50 ng/μL；内参基因：TAF10；变性：95 °C 10 min；循环：45次（95 °C 15 s，60 °C 60 s）；RNA储存：−80 °C；cDNA储存：−20 °C
2.6 蛋白质印迹
蛋白提取时，转化子No. 06、No. 26与No. 31于30 °C培养24与48 h。培养后的酵母细胞在裂解缓冲液（50 mM磷酸钠，pH 7.4；1 mM PMSF；1 mM EDTA；5%甘油；6 M尿素）中用硅珠（425–600 μm，G8772，Sigma，美国）于匀浆器（CLUBIO Prep-CB24，台湾）中裂解。裂解液于4 °C、13,000 rpm离心10 min澄清，随后用10%三氯乙酸（TCA）沉淀。沉淀用冷丙酮（Macron，美国）洗涤三次，风干，重悬于30 μL 4× LDS缓冲液（GenScript，美国）。样品95 °C加热5 min，进行SDS-PAGE分析。蛋白转膜按Huang等（Huang et al., 2024）使用全湿式快速蛋白质印迹系统（eBlot L1 Transfer System，GenScript，美国）。SeNCED检测时，PVDF膜与HRP-6× His一抗（1:5000，ProteinTech，美国）孵育。内参检测时，膜与GAPDH一抗（1:20,000，Elabscience，美国）孵育，随后与HRP偶联山羊抗兔IgG二抗（1:5000，GeneTex，美国）孵育。化学发光检测用ECL™试剂（Amersham，英国），信号由ImageQuant LAS 4000系统（GE，美国）捕获。ImageJ软件用于以GAPDH归一化条带强度并评估SeNCED表达水平。
【数据】菌株：No. 06、No. 26、No. 31；温度：30 °C；时间：24、48 h（No. 26另测72 h）；裂解缓冲液：50 mM磷酸钠pH 7.4、1 mM PMSF、1 mM EDTA、5%甘油、6 M尿素；硅珠：425–600 μm；离心：13,000 rpm、10 min、4 °C；TCA：10%；LDS缓冲液：30 μL 4×；加热：95 °C 5 min；SeNCED一抗：1:5000；GAPDH一抗：1:20,000；二抗：1:5000；目标蛋白分子量：54.8 kDa
2.7 基于阿魏酸消耗的菌株筛选试验
十株酵母培养于补充100 mg/L阿魏酸的YPD。120 h后，每份培养物取200 μL上清测定阿魏酸浓度并计算推断的4VG生成潜力。酿酒酵母野生型645与转化菌株在YPD或YPG中预培养，转化子补充200 μg/mL G418，200 rpm、30 °C培养12–16 h。培养物调整OD600后，以初始OD600 0.05接种至100 mL新鲜培养基。发酵于30 °C进行5天，添加或不添加100 mg/L阿魏酸，阿魏酸在培养开始时加入且不再补加。于0、24、48、72、96与120 h各取1 mL样品，用微量离心机（Tominaga，台湾）6400 rpm离心，上清用于后续分析。阿魏酸消耗按Chen等（Chen et al., 2021）方法测定，用微板分光光度计（Beckman Coulter，美国）定量。200 μL上清在325 nm记录吸光度以确定阿魏酸浓度。校准曲线按Mertens等（Mertens et al., 2017）方法建立，使用溶于ddH₂O的阿魏酸标准品（Acros Organics B.V.B.A，美国），浓度1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20与100 mg/L。阿魏酸浓度（mg/L）按函数(1)计算：(1) y = x − 0.0668 / 0.0085，y为阿魏酸浓度（mg/L），x为325 nm记录的吸光度值，R² = 0.9994。阿魏酸消耗计算如下：酵母对阿魏酸的摄取量由初始阿魏酸浓度（100 mg/L）减去培养基中残留阿魏酸浓度获得；随后以生物量归一化的总阿魏酸消耗量，由除以干细胞重（D……原文此处节选截断）。
【数据】阿魏酸初浓度：100 mg/L；筛选时长：120 h；取样体积：200 μL；检测波长：325 nm；标准品浓度：1–100 mg/L（13个点）；校准曲线：y = (x − 0.0668)/0.0085，R² = 0.9994；预培养：200 rpm、30 °C、12–16 h；接种OD600：0.05；发酵体积：100 mL；发酵温度：30 °C；发酵时长：5天；取样时间点：0、24、48、72、96、120 h；离心：6400 rpm
2.8 香兰素产量定量与数据分析
（原文节选未包含此小节，故不译。）
研究结果
3.1 酵母菌株特性
十株酵母在YPD琼脂上培养1–2天，于100×放大下观察菌落形态（图1A）。所有菌株均呈纯净、光滑、灰白色菌落。通过绘制生长曲线评估10株酵母的生长动力学，并计算世代时间（小时/代，Min/N）（图1B；表1）。酿酒酵母007（95.4 min）、1318（103.2 min）与1968（87.6 min）的生长速率较其他菌株慢，其余菌株生长曲线一致。酵母菌株经引物对ITS1-F/ITS4-R和/或NS7/ITS4（Toju et al., 2012）扩增ITS区PCR鉴定。序列比对结果（表1）将S. p. 029鉴定为Wickerhamomyces anomalus（100%同源性），S. c. 3068鉴定为Saccharomyces kudriavzevii（100%同源性）。由于基于ITS的鉴定对近缘或杂交酿造酵母分辨率有限，亦参考了相应商业菌株可得的全基因组信息。基于公开的全基因组信息，WLP029被归为Saccharomyces pastorianus 029（Langdon et al., 2019），Wyeast 3068被归为Saccharomyces cerevisiae 3068（Garge et al., 2024）。其余八株鉴定为酿酒酵母，序列同源性>99%。乙醇与乙酸乙酯产量经GC定量，样品浓度见图1C。酿酒酵母588乙酸乙酯产量最高（3.7 mg/mL），其次为酿酒酵母534（0.67 mg/mL）与酿酒酵母007（0.62 mg/mL）。乙醇产量最高见于酿酒酵母3068（1.05%），其次为酿酒酵母645（0.98%），其余菌株均低于0.3%。
【数据】培养时间：1–2天；放大倍数：100×；世代时间：007为95.4 min、1318为103.2 min、1968为87.6 min；ITS同源性：W. anomalus 100%、S. kudriavzevii 100%、其余8株>99%；乙酸乙酯：588为3.7 mg/mL、534为0.67 mg/mL、007为0.62 mg/mL；乙醇：3068为1.05%、645为0.98%、其余<0.3%
3.2 POF相关基因分析与推断的4VG生成潜力
为评估各菌株推断的4VG生成潜力，对PAD1与FDC1进行PCR与测序分析，并测定阿魏酸消耗作为POF活性的功能指标。负责将阿魏酸转化为4VG的PAD1与FDC1基因，在除S. p. 029外的所有菌株中均被检出（图2A）。基于ITS的系统发育树见图2B，推断的4VG生成潜力作为关联表型信息标注于树上。基于阿魏酸消耗，推断4VG生成潜力最高的为酿酒酵母645（65.89%），其次为酿酒酵母3068（57.27%）。其余菌株均低于20%。因此，选择酿酒酵母645进行后续代谢工程。
【数据】基因：PAD1、FDC1（除S. p. 029外均检出）；4VG生成潜力：645为65.89%、3068为57.27%、其余<20%；阿魏酸初浓度：100 mg/L（见2.7）
3.3 香兰素生物合成途径的构建
为建立经POF转化的香兰素生物合成途径（图3A），携带9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因（SeNCED）的表达质粒pYES2-SeNCED-G418经电穿孔导入酿酒酵母645。选取三个潜在转化子No. 6、No. 26与No. 31用于下游分析。为评估SeNCED蛋白表达，三个转化子于30 °C培养24与48 h。此外，No. 26另检测72 h以评估延长表达情况。提取总蛋白并以蛋白质印迹分析，靶向54.8 kDa的SeNCED蛋白。各时间点表达水平见图3B（上panel）。No. 06在24 h表达最高，而No. 26在24与48 h之间表达稳定。GAPDH作为内参见图3B（下panel）。为验证表达准确性，用ImageJ软件以对内参归一化SeNCED水平。如图3B所示，No. 06在24 h表达最高，但至48 h急剧下降。No. 26在24 h表达第二高，并在48与72 h维持稳定水平。No. 31虽在24 h表达最低，但至48 h虽略有下降仍超过No. 06。因此，所有转化子均被选入香兰素产量比较分析。
【数据】质粒：pYES2-SeNCED-G418；宿主：S. cerevisiae 645；转化子：No. 6、No. 26、No. 31；培养温度：30 °C；取样时间：24、48 h（No. 26另测72 h）；目标蛋白：SeNCED 54.8 kDa；内参：GAPDH；No. 06：24 h最高、48 h急剧下降；No. 26：24 h第二高、48–72 h稳定；No. 31：24 h最低、48 h超过No. 06
3.4 阿魏酸消耗与香兰素产量定量
测定野生型酿酒酵母645与转化子No. 6、No. 26、No. 31随时间变化的阿魏酸消耗，以评估香兰素产量（图3D）。24 h时，消耗水平（mg/g DCW）分别为1.32 ± 0.38、3.49 ± 0.27、14.40 ± 0.23与4.77 ± 0.24。48 h时，这些值增至3.60 ± 0.26、8.29 ± 0.33、15.11 ± 0.31与11.60 ± 0.19。72至120 h，No. 6与No. 31的阿魏酸消耗高于No. 26。总体而言，No. 26在24与48 h阿魏酸摄取最高，而No. 6与No. 31至120 h超过之。基于阿魏酸消耗效率，选取No. 6与No. 26比较香兰素产量。HPLC结果（图3E）显示，No. 06在24与48 h分别产65.74 ± 0.19与48.49 ± 0.05 mg/g DCW，但72 h后未检出香兰素。相反，No. 26在24与48 h产44.85 ± 1.69与62.1 ± 1.75 mg/g DCW，并在72与96 h维持产量，分别为44.25 ± 5.72与55.63 ± 10.67 mg/g DCW。野生型菌株至72 h才开始产香兰素，72与96 h产量分别为30.49 ± 0.51与35.43 ± 3.48 mg/g DCW。与蛋白质印迹结果比较，SeNCED表达与香兰素产量呈强相关。No. 06在24 h表达与产量较高，但48 h后急剧下降。相反，No. 26在72 h内维持稳定蛋白表达与持续香兰素生产，在持续香兰素生物合成上表现更优。
【数据】阿魏酸消耗（mg/g DCW）：24 h为WT 1.32 ± 0.38、No. 6 3.49 ± 0.27、No. 26 14.40 ± 0.23、No. 31 4.77 ± 0.24；48 h为WT 3.60 ± 0.26、No. 6 8.29 ± 0.33、No. 26 15.11 ± 0.31、No. 31 11.60 ± 0.19；香兰素（mg/g DCW）：No. 06 24 h 65.74 ± 0.19、48 h 48.49 ± 0.05、72 h后未检出；No. 26 24 h 44.85 ± 1.69、48 h 62.1 ± 1.75、72 h 44.25 ± 5.72、96 h 55.63 ± 10.67；WT 72 h 30.49 ± 0.51、96 h 35.43 ± 3.48
3.5 碳氢化合物产量分析
野生型酿酒酵母645与转化子No. 6、No. 26、No. 31的乙醇产量分别为0.84 ± 0.03%、0.85 ± 0.03%、0.90 ± 0.10%与0.79 ± 0.09%，无显著差异（P > 0.05）（图4A）。乙酸乙酯产量在野生型为42.95 ± 2.04 μg/mL，各转化子为37.77 ± 2.09、37.69 ± 1.04与37.28 ± 0.12 μg/mL。统计分析显示野生型乙酸乙酯产量显著高于转化子（P < 0.05），转化子之间无显著差异（图4B）。碳氢化合物代谢物包括乙醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯与辛酸乙酯，经GC定量并以热图可视化（图4C）。醇浓度归一化为1%，酯浓度归一化为5 mg/mL。12 h时，未补充阿魏酸培养的野生型乙醇水平最高。异戊醇水平在No. 6与No. 31的48 h升高，与是否添加阿魏酸无关。苯乙醇产量在所有菌株间无显著差异（P > 0.05）。酯类方面，乙酸乙酯、乙酸丁酯或辛酸乙酯水平在菌株间无显著差异（P > 0.05），与阿魏酸补充无关。值得注意的是，No. 6在补充阿魏酸培养基的24 h产乙酸异戊酯最高。此外，其在未补充的24 h与补充的48 h己酸乙酯水平最高，表明酯类生物合成能力增强。
【数据】乙醇：WT 0.84 ± 0.03%、No. 6 0.85 ± 0.03%、No. 26 0.90 ± 0.10%、No. 31 0.79 ± 0.09%（P > 0.05）；乙酸乙酯：WT 42.95 ± 2.04 μg/mL、No. 6 37.77 ± 2.09、No. 26 37.69 ± 1.04、No. 31 37.28 ± 0.12 μg/mL（WT vs 转化子 P < 0.05）；归一化：醇1%、酯5 mg/mL；苯乙醇：P > 0.05；乙酸乙酯/乙酸丁酯/辛酸乙酯：P > 0.05；No. 6乙酸异戊酯最高：24 h（补充阿魏酸）；No. 6己酸乙酯最高：24 h（未补充）、48 h（补充）
3.6 经HS-SPME-GC–MS的香气化合物分析
挥发性化合物经HS-SPME-GC–MS分析并以热图可视化（图5A）。检出化合物类别包括醇、酸、酯、烷烃、醛、醚、酚、酮与烯烃。本实验检出的宽泛化合物类别与近期HS-SPME/GC–MS研究一致，表明啤酒与酒花相关挥发性轮廓涵盖多个化学家族，包括醇、酯、醛、酸、萜烯、酚类化合物与烃类（Herkenhoff et al., 2024a; Herkenhoff, Praia, et al., 20……原文此处节选截断）。
【数据】分析平台：HS-SPME-GC–MS；检出类别：醇、酸、酯、烷烃、醛、醚、酚、酮、烯烃（共9类）；原文其余定量数值未详述（节选截断）
讨论与解读
本研究比较了十株商业酵母的生长速率、乙醇与乙酸乙酯产量及推断4VG生成潜力。酿酒酵母588虽细胞密度较高，但推断4VG生成潜力低于645与3068。总体上，乙酸乙酯与推断4VG生成潜力呈负相关，乙醇水平与4VG正相关。乙酸乙酯由乙醇与乙酰辅酶A经醇乙酰转移酶Atf1与Atf2合成（Nancolas et al., 2017）。阿魏酸消耗与4VG生成潜力增强可能使代谢流转向苯丙烯酸途径，减少用于酯合成的乙酰辅酶A（Vuralhan et al., 2003）。此外，阿魏酸与4VG等芳香中间体积累可造成代谢胁迫，进而抑制脂质与酯类生物合成（Hazelwood et al., 2008）。因此，PAD1/FDC1活性升高可能通过竞争乙酰辅酶A与NADPH间接抑制乙酸乙酯生产。该负相关仍需进一步实验验证，但既有研究支持芳香酸积累改变碳流分布、限制酯合成的观点（Hazelwood et al., 2008; Vuralhan et al., 2003）。9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶蛋白（SeN……原文节选截断）。
编译者解读：把"异味前体"变"高值香料"是本案最巧妙之处——不删除POF路径，而是在其下游接一个裂解酶，把4VG直接氧化为香兰素，碳流不改道、只改终点。No. 26的价值不在峰值产量（65.74 mg/g DCW 的 No. 06 更高），而在48–96 h的持续输出，这对分批酿造的时间窗更友好。局限也明显：香兰素本身是香气活性物，过量会带来新的风味偏移；SeNCED依赖GAL1诱导与G418抗性，离食品级无标记菌株尚有距离。真正落地还需在真实麦汁基质中评估4VG残留与感官阈值。
参考来源
期刊：Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2026
DOI: 10.1016/j.ifset.2026.104884
DOI: 10.1016/j.ifset.2026.104884