来源：Anti-virulence potential of Aegle marmelos (L.) and Cordia dichotoma (L.): Quorum sensing related and Antibiofilm activities with Phytochemical profiling（Biocatalysis and Agricultural Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗生素耐药性持续加剧，靶向细菌毒力而非直接杀菌的策略受到关注。本研究以印度传统药用植物木橘（Aegle marmelos）和破布木（Cordia dichotoma）叶片的乙酸乙酯-水提取物为对象，系统评价了其抗菌、抗生物膜、抗氧化及群体感应（QS）抑制活性，并结合TLC、HPLC、GC-MS与分子对接解析活性成分。结果显示两种提取物在亚抑菌浓度下即可显著抑制紫色杆菌素产生与金黄色葡萄球菌生物膜形成，且对HaCaT细胞毒性较低，为植物源抗毒力制剂的开发提供了实验依据。
研究背景
抗生素滥用导致的抗菌药物耐药（AMR）已成为全球健康问题。传统抗生素疗效不断下降，造成病程延长、医疗费用上升与死亡率增加。2017年WHO发布了需优先关注的耐药病原体清单，即ESKAPE病原体，并强调亟需开发超越传统杀菌/抑菌手段的新型治疗策略。AMR的威胁并不限于临床——在农业领域，铜制剂、抗生素与化学杀菌剂的反复使用已诱发抗性变异株，并带来环境污染与脱靶效应等问题。丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）、黄单胞菌（Xanthomonas）和放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）等植物病原菌造成严重作物损失，迫切需要新型抗菌剂。与直接抑制细菌活力相比，抑制细菌毒力的替代策略对可持续作物保护更具价值。细菌群体感应（QS）协调与细菌存活、毒力和持久性相关的群体行为，已被置于抗菌药物耐药研究的框架下考察。基于此，本研究同时评价植物提取物的抗菌潜力及其干扰QS相关系统的能力。
研究方法
2.1 植物提取物制备
木橘（A. marmelos）与破布木（C. dichotoma）叶片分别采自印度昌迪加尔的CSIR-IMTECH（30.7486, 76.7339）与昌迪加尔植物园及自然公园（Sarangpur, Chandigarh, India，30.786, 76.756）。叶片遮阴干燥一周后粗粉碎。提取物按Tamokou等（2012）所述方法制备。取20 g叶粉，于25 °C在200 mL乙酸乙酯中浸泡过夜，随后在摇床培养箱（New Brunswick Innova 44, Eppendorf, Germany）中以150 rpm振荡。选择乙酸乙酯是基于其中等极性——可有效提取多种植物化学成分，且低沸点便于去除。所得悬液经Whatman 1号滤纸过滤。该过程重复两次，滤液合并。随后使用旋转蒸发仪（Heidolph™ Hei-VAP Rotary Evaporator, Germany）在45 °C、60 rpm条件下减压蒸发。浓缩提取物用真空浓缩仪（Eppendorf® Concentrator Plus, Germany）在30 °C下干燥。干燥粗提物得率：木橘11.5%，破布木12.8%。干燥粗提物以无菌蒸馏水悬浮至名义浓度100 mg/mL并充分涡旋。悬液于12000 rpm离心，分离不溶物与水溶性组分。弃去不溶沉淀，收集水相上清并用0.22 μm注射器滤器（Himedia, India）过滤除菌。回收的水溶性组分相当于100 mg木橘粗提物中的20 mg、100 mg破布木粗提物中的40 mg。除另有说明外，提取物浓度均以初始粗乙酸乙酯提取物（100 mg/mL）为基准的名义浓度表示（以下称EA-水提取物），该提取物未经进一步干燥或复溶即直接用于后续所有生物测定。
【数据】植物材料：木橘、破布木叶片；提取溶剂：乙酸乙酯200 mL；叶粉用量：20 g；浸泡温度：25 °C；浸泡时间：过夜；振荡转速：150 rpm；蒸发温度：45 °C；蒸发转速：60 rpm；干燥温度：30 °C；粗提物得率：木橘11.5%、破布木12.8%；名义浓度：100 mg/mL；离心转速：12000 rpm；滤膜孔径：0.22 μm；水溶组分回收：木橘20 mg/100 mg、破布木40 mg/100 mg
2.2 抗菌活性
木橘与破布木提取物的抗菌活性初筛采用琼脂孔扩散法（Balouiri等，2016），针对大肠杆菌ATCC 11775、鲍曼不动杆菌ATCC 15308及四种植物病原菌——丁香假单胞菌MTCC 11950ᵀ、放射形土壤杆菌MTCC 8917、茄病镰刀菌MTCC 2082与尖孢镰刀菌MTCC 2087进行评价。实验在机构生物安全委员会批准的BSL2设施内无菌操作（项目号：CSIR-IMTECH/IBSC/2024/Oct 23）。将过夜培养的Mueller-Hinton肉汤培养物涂布于Mueller-Hinton琼脂（MHA, Accumix, Tulip Diagnostics, India）平板，调至600 nm吸光度约0.1（OD600）制备菌 lawn。在平板上打孔，每孔加入100 μL各提取物（由名义100 mg/mL粗乙酸乙酯提取物制备的EA-水提取物）。庆大霉素（6.25 μg/mL）与潮霉素（50 μg/mL）分别作为细菌与真菌培养的阳性对照。细菌培养于37 °C、24 h，真菌培养于25 °C、48 h。使用HiAntibiotic zonescale-C（Himedia, India）记录抑菌圈（mm）以评价抗菌效力。
【数据】测试菌株：大肠杆菌ATCC 11775、鲍曼不动杆菌ATCC 15308、丁香假单胞菌MTCC 11950ᵀ、放射形土壤杆菌MTCC 8917、茄病镰刀菌MTCC 2082、尖孢镰刀菌MTCC 2087；培养基：Mueller-Hinton琼脂；接种浓度：OD600约0.1；加样量：100 μL/孔；阳性对照：庆大霉素6.25 μg/mL、潮霉素50 μg/mL；细菌培养：37 °C、24 h；真菌培养：25 °C、48 h
2.3 最小抑菌浓度（MIC）测定
采用EA-水提取物测定其对紫色杆菌ATCC 12472、金黄色葡萄球菌ATCC 6538P、大肠杆菌ATCC 11775、鲍曼不动杆菌ATCC 15308与铜绿假单胞菌MCC 2080的MIC。微量肉汤稀释法为测定细菌病原体MIC的常用方法，按前述方法（Teanpaisan等，2017）稍作修改进行。提取物在96孔板中以MHB培养基进行二倍系列稀释，制备50 mg/mL至1.56 mg/mL的浓度。庆大霉素（终浓度50 μg/mL）与水分别作为阳性与阴性对照。以1:100比例加入OD600约0.1的细菌接种物至各孔。37 °C培养24 h后，用分光光度计（Tecan, Infinite® 200 PRO, Switzerland）记录OD600，确定最低抑制浓度。
【数据】测试菌株：紫色杆菌ATCC 12472、金黄色葡萄球菌ATCC 6538P、大肠杆菌ATCC 11775、鲍曼不动杆菌ATCC 15308、铜绿假单胞菌MCC 2080；浓度范围：50–1.56 mg/mL（二倍稀释）；培养基：MHB；阳性对照：庆大霉素50 μg/mL；接种比例：1:100（OD600约0.1）；培养条件：37 °C、24 h；检测：OD600
2.4 紫色杆菌素抑制试验
紫色杆菌ATCC 12472作为群体感应生物传感器报告菌株。特征性紫色色素紫色杆菌素的产生受QS控制机制调控。由于紫色杆菌素产生是QS活性直接、易观察且可定量的表型标志，该菌株被广泛认可为筛选QS抑制剂的标准报告菌（Kothari等，2017；Zhang和Chu，2017）。两种植物提取物对紫色杆菌素抑制的定性分析采用孔扩散法，提取物加样孔周围产生褪色圈。EA-水提取物对紫色杆菌ATCC 12472的定量分析采用分光光度法（Venkatramanan等，2020a）。为确保紫色杆菌素产生受QS相关活性而非细菌生长抑制所抑制，试验在低于MIC的浓度（即6.2 mg/mL）下进行。简言之，在5 mL管中，将10 μL过夜培养物悬于1 mL含EA-水提取物（3.125–0.625 mg/mL）的MHB中，37 °C孵育24 h。对照孔含培养基与培养物但不含提取物。培养物离心15 min。弃去液相，沉淀重悬于1 mL二甲基亚砜。为确保紫色杆菌素完全溶解，样品充分混匀并以10000 rpm离心15 min以破碎细菌细胞释放紫色杆菌素。取100 μL上清加入96孔板，于585 nm测定吸光度。EA-水提取物存在下紫色杆菌素抑制百分比按以下公式计算。
【数据】报告菌株：紫色杆菌ATCC 12472；试验浓度：3.125–0.625 mg/mL（低于MIC 6.2 mg/mL）；培养体积：1 mL MHB；接种量：10 μL过夜培养物；培养条件：37 °C、24 h；离心：15 min、10000 rpm；重悬液：1 mL DMSO；检测波长：585 nm；上样量：100 μL/孔
2.5 生物膜抑制试验
采用结晶紫法（Pipattanachat等，2021）研究金黄色葡萄球菌ATCC 6538P的生物膜抑制。将1 mL MHB加入24孔板，制备EA-水提取物的二倍系列稀释液（12.5–0.1 mg/mL）。接种10 μL细菌培养物（OD600 0.1），37 °C静置培养24 h，用PBS洗涤三次去除浮游细胞。70%乙醇固定生物膜细胞20 min。随后用0.1%（w/v）结晶紫处理平板，静置20 min。洗涤三次去除多余染液。加入30%乙酸溶解结晶紫，测定OD585。提取物存在下生物膜抑制百分比按公式计算。
【数据】菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538P；培养基：MHB 1 mL/孔；提取物浓度：12.5–0.1 mg/mL（二倍稀释）；接种量：10 μL（OD600 0.1）；培养：37 °C、24 h静置；固定：70%乙醇20 min；染色：0.1%（w/v）结晶紫20 min；溶解：30%乙酸；检测：OD585
2.6 共聚焦激光扫描显微镜
生物膜共聚焦成像按Altaf等（2021）所述方法稍作修改进行。金黄色葡萄球菌ATCC 6538P在含与不含EA-水提取物（1.56 mg/mL与0.75 mg/mL）条件下，于12孔板内无菌盖玻片上37 °C形成生物膜24 h。盖玻片用1×PBS洗涤3次，以0.1%吖啶橙染色30 min。用1×PBS洗涤盖玻片3次去除多余染料，室温风干。使用Nikon A1plus共聚焦激光扫描显微镜（检测范围：488–525 nm；针孔尺寸：35.76，Nikon Instruments USA）观察生物膜。图像以60×采集，每种条件成像三个视野。
【数据】菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538P；提取物浓度：1.56 mg/mL与0.75 mg/mL；生物膜形成：37 °C、24 h；染色：0.1%吖啶橙30 min；洗涤：1×PBS 3次；检测范围：488–525 nm；针孔尺寸：35.76；放大倍数：60×；成像视野：3个/条件
2.7 细胞毒性试验
（原文节选至此结束，后续步骤原文未详述。）
研究结果
3.1 植物提取物的抗菌活性
对木橘与破布木乙酸乙酯粗提物的水溶组分（EA-水提取物）进行了抗细菌、真菌及植物病原菌活性评价（图1）。木橘EA-水提取物对鲍曼不动杆菌活性最强（20 mm），对大肠杆菌（17.3 mm）、放射形土壤杆菌（16.6 mm）、茄病镰刀菌（16 mm）、尖孢镰刀菌（16 mm）活性中等，对丁香假单胞菌活性最弱（9.3 mm）。破布木EA-水提取物对放射形土壤杆菌抑制活性最强（24 mm），对鲍曼不动杆菌（21 mm）、大肠杆菌（20 mm）、丁香假单胞菌（19.3 mm）活性中等，而对茄病镰刀菌与尖孢镰刀菌无抑制活性（补充文件表S1）。庆大霉素（6.25 μg/mL）与潮霉素（50 μg/mL）作为阳性对照验证抗菌活性。
【数据】木橘抑菌圈：鲍曼不动杆菌20 mm、大肠杆菌17.3 mm、放射形土壤杆菌16.6 mm、茄病镰刀菌16 mm、尖孢镰刀菌16 mm、丁香假单胞菌9.3 mm；破布木抑菌圈：放射形土壤杆菌24 mm、鲍曼不动杆菌21 mm、大肠杆菌20 mm、丁香假单胞菌19.3 mm、两种镰刀菌0 mm；阳性对照：庆大霉素6.25 μg/mL、潮霉素50 μg/mL
3.2 MIC值评价
采用二倍稀释（浓度范围1.56–50 mg/mL）评估EA-水提取物的MIC。木橘与破布木提取物的MIC值如下：对鲍曼不动杆菌ATCC 15308分别为6.2与1.56 mg/mL；对紫色杆菌ATCC 12472分别为12.5与6.25 mg/mL；对大肠杆菌ATCC 11775分别为12.5与3.12 mg/mL；对铜绿假单胞菌MCC 2080与金黄色葡萄球菌ATCC 6538P，两种提取物均为6.25 mg/mL（图2）。破布木对部分受试菌株的MIC值低于木橘，提示其抗菌效力更强（补充文件图S1）。例如，破布木提取物对大肠杆菌的MIC（3.12 mg/mL）远低于木橘提取物（12.5 mg/mL）。同样，对鲍曼不动杆菌，木橘提取物MIC为6.25 mg/mL，破布木为1.56 mg/mL。
【数据】MIC（木橘/破布木）：鲍曼不动杆菌6.2/1.56 mg/mL；紫色杆菌12.5/6.25 mg/mL；大肠杆菌12.5/3.12 mg/mL；铜绿假单胞菌6.25/6.25 mg/mL；金黄色葡萄球菌6.25/6.25 mg/mL；浓度范围1.56–50 mg/mL
3.3 紫色杆菌素抑制
以紫色杆菌ATCC 12472为生物传感器菌株，评价植物提取物对紫色杆菌素产生的抑制作用。在紫色杆菌生物传感器试验中，两种提取物均呈浓度依赖性抑制紫色杆菌素产生，为干扰QS调控表型提供了初步证据。紫色杆菌素含量随提取物浓度升高显著下降，在测试条件下1.56 mg/mL时观察到紫色杆菌素产生完全抑制（图3）。为评估所观察到的紫色杆菌素产生抑制是否与细菌生长抑制相关，测定了相应提取物浓度下的OD600（图3）。在显示显著抑制紫色杆菌素产生的浓度下，两种提取物均未引起OD600的统计学显著下降，表明所观察到的减少并未伴随测试条件下生长的显著降低。这些发现证明提取物影响了紫色杆菌生物传感器系统中的QS调控表型。然而，这并不指示导致所观察抑制的任何具体分子机制或靶点。
【数据】菌株：紫色杆菌ATCC 12472；紫色杆菌素完全抑制浓度：1.56 mg/mL；检测波长：585 nm；生长检测：OD600；结果：OD600无统计学显著下降（原文未给出具体OD600数值）
3.4 生物膜抑制
采用结晶紫法分析对金黄色葡萄球菌ATCC 6538P的生物膜抑制。两种植物提取物随浓度升高均显示生物膜形成抑制。在1.56 mg/mL时，木橘抑制率超过50%，破布木超过70%，两种提取物的有效浓度均记为3.12 mg/mL（图4(a)）。共聚焦显微镜图像显示，与对照相比，木橘与破布木EA-水提取物处理的生物膜存在明显差异（图4(b)）。对照玻片显示发育良好、致密的生物膜，而处理样品显示生物膜结构减少且不够紧凑。这些结果表明两种植物提取物抑制了生物膜生物量的形成。
【数据】菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538P；1.56 mg/mL抑制率：木橘>50%、破布木>70%；有效浓度：3.12 mg/mL（两种提取物）；检测：结晶紫法OD585；共聚焦：60×，3视野/条件
3.5 细胞毒性试验
采用MTT与Alamar Blue法在HaCaT细胞系中评价EA-水提取物的细胞毒性。与未处理对照相比，浓度≤3.125 mg/mL时未检测到细胞活力的显著差异。木橘提取物在6.25 mg/mL至12.5 mg/mL范围内观察到细胞活力依次下降。破布木提取物在浓度≥6.25 mg/mL时细胞活力下降更明显。相比之下，3.125 mg/mL时细胞活力保持相对最佳（图5）。总体而言，在测试条件下，与抑制QS调控的紫色杆菌素表型和生物膜生物量形成相对应的浓度下，提取物未显示显著细胞毒性。
【数据】细胞系：HaCaT角质形成细胞；方法：MTT法、Alamar Blue法；无显著毒性浓度：≤3.125 mg/mL；木橘活力下降区间：6.25–12.5 mg/mL；破布木活力明显下降：≥6.25 mg/mL；最佳活力浓度：3.125 mg/mL
3.6 抗氧化——自由基清除
在1.56–100 mg/mL浓度范围内评价两种植物EA-水提取物的DPPH自由基清除活性。两种提取物均显示DPPH自由基清除活性随浓度升高而增强，表明测试条件下具有抗氧化活性（图6(a)）。在使用HaCaT细胞系评估氧化应激去除后细胞活力的细胞试验中，木橘提取物在3 mg/mL时提高细胞活力，而较低浓度则伴随细胞活力下降（图6(b)）。破布木未显示一致的浓度依赖性细胞活力效应；但在测试浓度下，细胞活力优于相应的氧化应激对照。结果表明两种提取物具有抗氧化或细胞保护作用。
【数据】DPPH浓度范围：1.56–100 mg/mL；木橘提升细胞活力浓度：3 mg/mL；检测：DPPH自由基清除百分比、HaCaT细胞活力
3.7 植物化学筛查
本研究中提取物最初以乙酸乙酯制备，随后溶于水。在此类情况下，预期化合物可能为部分极性酚类（如咖啡酸、没食子酸，若存在）、小分子黄酮（如槲皮素或木犀草素苷元，可能微溶）以及可能少量皂苷或小极性香豆素。总黄酮含量测定为：木橘39.22 ± 3.29 mg QE/g，破布木22.79 ± 2.42 mg QE/g。总酚含量估计为：木橘7.57 ± 0.03 mg GAE/g，破布木5.23 ± 0.17 mg GAE/g。木橘与破布木的黄酮与酚类含量与已报道值相当。两种植物提取物中还检测到其他植物化学成分，包括单宁、醌类、萜类、强心苷与生物碱。作为木橘与破布木中鉴定出的两大类植物化学成分，黄酮与酚类化合物进一步通过薄层色谱表征（图7）。在黄酮的TLC分析中，两种提取物在紫外光下均观察到多条蓝色与绿色荧光条带，提示存在多种黄酮类化合物。对于酚类化合物，木橘提取物TLC显示单一清晰黑色条带，表明存在一种主要酚类化合物；破布木提取物则显示一条清晰黑色条带和一条浅色条带，表明存在多种浓度不同的酚类化合物。
【数据】总黄酮：木橘39.22 ± 3.29 mg QE/g、破布木22.79 ± 2.42 mg QE/g；总酚：木橘7.57 ± 0.03 mg GAE/g、破布木5.23 ± 0.17 mg GAE/g；其他成分：单宁、醌类、萜类、强心苷、生物碱；TLC对照：槲皮素（黄酮）、没食子酸（酚类）、水（阴性）
3.8 HPLC与GC-MS分析
收集两种植物EA-水提取物HPLC分离所得各峰，评价其抗菌与QS相关活性。在木橘的色谱分析中，保留时间3.3 min处的一个显著峰对紫色杆菌显示抗菌与紫色杆菌素产生抑制活性，此时流动相组成对应56.7%溶剂B。对于破布木，保留时间4.2 min处的峰在流动相含55%溶剂B时对紫色杆菌显示活性（图8a、8b，活性峰圈出）。通过将所得质谱与……（原文节选至此结束，后续内容原文未详述）比较，分析了两种植物HPLC分离活性组分的GC-MS图谱。
【数据】木橘活性峰保留时间：3.3 min（溶剂B 56.7%）；破布木活性峰保留时间：4.2 min（溶剂B 55%）；活性指标：抗紫色杆菌、紫色杆菌素产生抑制
3.9 分子对接
（原文结果节选未包含此部分正文，相关图示见清单。）
讨论与解读
AMR是日益严重且常被忽视的全球健康威胁，具有引发大流行的重大潜在风险。ESKAPE病原体被认为是AMR负担增加的主要原因。细菌QS在协调与细菌存活、毒力和持久性相关的群体活动中发挥重要作用，并已在抗菌药物耐药背景下得到研究。本研究既评价植物提取物的抗菌潜力，也评价其干扰QS相关系统的能力。研究结果与既往关于两种植物抗菌特性的报道一致：木橘已被报道对包括植物病原菌和真菌在内的广谱细菌具有活性，而破布木主要显示抗细菌病原体活性；其叶、果、花、皮等多个部位已用不同溶剂提取物研究，并报道了抑制多种微生物的有效性。多项研究记录了木橘叶与花甲醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌与鲍曼不动杆菌，以及白色念珠菌与热带念珠菌的抗菌活性。
编译者解读：该研究将"抗毒力"作为核心卖点，用紫色杆菌素报告系统在亚抑菌浓度下区分QS抑制与生长抑制，这一实验设计在合成生物学筛选中具有可移植性——报告菌株可直接改造为高通量筛选底盘。局限也明显：HPLC活性峰仅以保留时间定位，GC-MS成分与对接结果之间缺少敲除或纯品验证，QS靶点（CviR/AgrA）的相互作用仍停留在计算预测层面。若后续把活性单体在工程化QS报告系统中做剂量-效应验证，这类植物提取物才有望成为抗毒力元件的可靠来源。
参考来源
期刊：Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104306
DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104306