来源：Engineering a microbial platform for the biosynthesis of anthranilic acid and its derivatives（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
邻氨基苯甲酸（ANTA）及其衍生物N-甲基邻氨基苯甲酸（NMAA）和3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）是医药与化工领域的重要芳香族化合物，但微生物合成一直受限于产量低和途径不完整。本研究通过系统代谢工程构建了大肠杆菌ANTA生产平台，摇瓶产量达3.25 g/L；并在此基础上延伸途径，实现NMAA摇瓶产量524 mg/L、3-HAA在3 L生物反应器中产量2.79 g/L，为芳香族化合物的可持续生物制造提供了可扩展的平台。
研究背景
ANTA是一种重要的芳香胺化合物，广泛用于医药、农药和精细化工行业。在医药领域，它是合成非甾体抗炎药、镇静剂和维生素的关键中间体；在农药领域可用于生产杀虫剂和杀菌剂；同时也是染料、香料等精细化学品的原料。更重要的是，ANTA可作为前体合成多种更高价值的下游衍生物，包括NMAA、3-HAA、邻氨基苯甲酸甲酯和5-羟基邻氨基苯甲酸。其中NMAA是合成生物碱、药物及荧光染料等功能材料的多用途中间体；3-HAA具有抗氧化和抗炎活性，在神经保护剂和喹啉类化合物开发中展现潜力，还可作为植物生长调节剂。
目前这些化合物主要依赖化学合成。ANTA通常以邻苯二甲酸酐为原料，经胺化、Hofmann重排和酸化等多步反应制得，所用试剂环境负担较重。微生物合成路线虽具可持续潜力，却长期受制于产量低、途径不完整等问题。本研究即以大肠杆菌为宿主，通过系统代谢工程打通并延伸ANTA合成途径。
研究方法
2.1 培养基、菌株与质粒
LB培养基由10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl组成，用于菌株培养和质粒组装。摇瓶发酵在M9Y培养基中进行，其组成为3 g/L KH2PO4、6.78 g/L Na2HPO4、1 g/L NH4Cl、0.5 g/L NaCl、2 g/L MOPS、7 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、0.2 g/L酪氨酸和0.2 g/L苯丙氨酸。此外，培养基中加入微量元素溶液，含6 mg/L FeSO4·7H2O、2 mg/L ZnSO4·7H2O、2 mg/L MnCl2·4H2O、1 mg/L CoCl2·6H2O和0.3 mg/L CuSO4·5H2O。补料分批发酵培养基配方与摇瓶培养基本相同，但酵母提取物增至10 g/L，且1 g/L NH4Cl替换为2 g/L (NH4)2SO4。需要时向培养基中加入抗生素：壮观霉素120 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素100 μg/mL、氯霉素100 μg/mL。质粒组装使用商业化大肠杆菌菌株Trans5α。高拷贝载体pET-lac、中拷贝载体pCS27和低拷贝载体pSA74作为质粒组装的骨架质粒（Lin et al., 2013）。pTarget和pCas9质粒用于CRISPR/Cas9基因组编辑（Jiang et al., 2015）。本研究所用菌株和质粒见表1和表2。
【数据】蛋白胨：10 g/L；酵母提取物：5 g/L（LB）/7 g/L（M9Y）/10 g/L（补料）；NaCl：10 g/L（LB）/0.5 g/L（M9Y）；葡萄糖：20 g/L（摇瓶）/15 g/L（补料初始）；MgSO4：1 mM；CaCl2：0.1 mM；酪氨酸：0.2 g/L；苯丙氨酸：0.2 g/L；壮观霉素：120 μg/mL；氨苄青霉素：100 μg/mL；卡那霉素：100 μg/mL；氯霉素：100 μg/mL；原文未详述培养温度与时间（本节）
2.2 DNA操作
将源自大肠杆菌MG1655的trpE和trpG基因通过KpnI和BamHI限制性位点克隆至pET-lac载体，构建质粒pET-lac-trpE-trpG。随后依据已有文献报道引入相应突变，获得pET-lac-trpE fbr-trpG。用于NMAA生产，合成来自芸香（Ruta graveolens）的RgANMT基因、来自兔（Oryctolagus cuniculus）和人（Homo sapiens）的RPNMT和HPNMT基因、来自咖啡（Coffea arabica）的CaXMT1和CTgS1基因、来自瓜拉纳（Paullinia cupana）的PcCS1和PcCS2基因、来自巴拉圭冬青（Ilex paraguariensis）的IPCS1、IPCS2和IPCS3基因、来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AT3G53140基因、来自大豆（Glycine max）的NANMT-1基因以及来自罂粟（Papaver somniferum）的PsCNMT基因，随后分别通过KpnI和BamHI克隆至pET-lac载体，获得质粒pET-lac-RgANMT、pET-lac-RPNMT、pET-lac-HPNMT、pET-lac-CaXMT1、pET-lac-PcCS1、pET-lac-PcCS2、pET-lac-IPCS1、pET-lac-IPCS2、pET-lac-IPCS3、pET-lac-AT3G53140、pET-lac-CTgS1、pET-lac-NANMT-1和pET-lac-PsCNMT。用于3-HAA生产，将来自施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的基因簇phKLMNOPQ、来自热脱氮地芽孢杆菌NG80-2（Geobacillus thermodenitrificans NG80-2）的GTNG_3160和GTBG_3158基因、来自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、浑浊红球菌B-4（Rhodococcus opacus B-4）、铜绿假单胞菌PAO1（P. aeruginosa PAO1）和大肠杆菌MG1655的hpaBC基因，以及来自铜绿假单胞菌的pobA基因，通过KpnI和BamHI克隆至pCS-lac或pET-lac载体，由此构建质粒pCS-lac-phKLMNOPQ、pCS-lac-KphpaBC、pCS-lac-RohpaBC、pCS-lac-PahpaBC、pCS-lac-EchpaBC、pCS-lac-pobA、pCS-lac-GTNG_3160-GTNG_3158和pET-lac-GTNG_3160-GTNG_3158。本研究所用N-甲基转移酶和羟化酶的氨基酸序列列于表S1和表S2。所用外源基因的登录号和启动子序列列于表S3和表S4。
【数据】限制性位点：KpnI、BamHI；载体：pET-lac、pCS-lac；候选N-甲基转移酶基因数：13个；羟化酶来源：6种以上；基因簇：phKLMNOPQ；酶：GTNG_3160、GTNG_3158；原文未详述反应温度与时间（本节）
2.3 基因组改造
基因缺失（包括tyrA、pheA和tyrR）以及基因整合（包括于yijP和yciQ位点整合trpE fbr-trpG、于ilvG位点整合aroG fbr-aroB-aroD）均采用CRISPR/Cas9系统按文献所述流程完成（Jiang et al., 2015）。进行基因组整合时，首先将质粒pCas9导入宿主菌。通过PCR扩增假基因位点的上游和下游同源臂以及目标基因片段，随后经重叠延伸PCR融合这些片段。将所得线性DNA片段与携带相应gRNA的pTarget质粒共导入含pCas9的宿主菌。鉴定阳性菌落后，通过在含3 g/L L-阿拉伯糖的LB培养基中培养以消除pTarget，随后于42 °C培养去除pCas9。
【数据】缺失基因：tyrA、pheA、tyrR；整合位点：yijP、yciQ、ilvG；整合元件：trpE fbr-trpG、aroG fbr-aroB-aroD；L-阿拉伯糖：3 g/L；pCas9消除温度：42 °C；原文未详述培养时间
2.4 从头合成与补料分批发酵
摇瓶实验中，生产菌株首先在37 °C的LB培养基中培养，随后转接至装有无菌50 mL M9Y培养基的250 mL挡板摇瓶。当OD600达到2.0时，加入0.5 mM IPTG诱导质粒表达，摇瓶于33 °C、220 rpm振荡培养。每隔12 h取样1 mL，测定OD600并通过HPLC分析产物生成。补料分批发酵中，菌株首先于37 °C培养，然后接入3 L生物反应器。通过添加乙酸或氢氧化铵将pH自动控制在7.0。通过自动控制搅拌转速在200 rpm至800 rpm之间，将溶解氧（DO）维持在20-30%。当OD600接近10.0时，加入IPTG激活基因表达，温度由37 °C降至33 °C。初始葡萄糖浓度为15 g/L，耗尽后补加500 g/L葡萄糖母液，使发酵过程中葡萄糖浓度维持在10 g/L以下。
【数据】诱导OD600：2.0（摇瓶）/10.0（反应器）；IPTG：0.5 mM；摇瓶温度：33 °C；摇瓶转速：220 rpm；反应器pH：7.0；DO：20-30%；搅拌：200-800 rpm；初始葡萄糖：15 g/L；补料葡萄糖母液：500 g/L；补料期葡萄糖上限：<10 g/L；取样间隔：12 h
2.5 RT-qPCR
参照文献既定方法（Sheng et al., 2025），生产菌株在50 mL M9Y培养基中培养24 h，提取总RNA进行逆转录PCR和qPCR。以gapA基因为内参，采用2−ΔΔCT法测定相对转录水平。
【数据】培养体积：50 mL；培养时间：24 h；内参基因：gapA；分析方法：2−ΔΔCT；原文未详述培养温度
2.6 分析方法
培养液中ANTA、NMAA和3-HAA的浓度采用SHIMADZU HPLC系统测定。甲醇为有机流动相，水相为含0.2‰三氟乙酸的水溶液。柱温设为40 °C，梯度条件如下：5%甲醇（0-1 min）、5-35%甲醇（1-10 min）、35-85%甲醇（10-20 min）、85-90%甲醇（20-21 min）、10%甲醇（21-25 min）。采用255 nm和300 nm双波长检测，以255 nm处紫外吸收峰面积定量。本研究数据来自三次独立实验。
【数据】柱温：40 °C；三氟乙酸：0.2‰；检测波长：255 nm、300 nm；梯度：5%→35%→85%→90%→10%甲醇；时间：0-25 min；重复次数：3次
2.7 酶活测定
将质粒构建体pETDuet-GTNG_3160和pETDuet-GTNG_3158分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)。挑取新鲜转化菌落接种至4 mL LB培养基，37 °C培养12 h。种子液转接至100 mL LB培养基，继续培养2 h后加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，培养物于16 °C继续培养20 h。蛋白纯化时收集细胞并超声破碎。GTNG_3160和GTNG_3158的酶活于200 μL反应体系中测定，体系含2 mM NADPH、1 mM FAD、1 μM GTNG_3160、1 μM GTNG_3158、20 mM Tris-HCl（pH 9.0）以及浓度0至1 mM的底物ANTA。反应混合物于37 °C孵育20 min，加入纯甲醇终止反应。样品经HPLC分析。表观动力学参数采用Origin2023软件对Michaelis-Menten方程进行非线性回归拟合确定。
【数据】种子培养：4 mL LB、37 °C、12 h；表达培养：100 mL LB、2 h后诱导；IPTG：0.5 mM；诱导后温度：16 °C；诱导时间：20 h；反应体积：200 μL；NADPH：2 mM；FAD：1 mM；酶浓度：各1 μM；Tris-HCl：20 mM、pH 9.0；底物ANTA：0-1 mM；反应温度：37 °C；反应时间：20 min；拟合软件：Origin2023
研究结果
3.1 ANTA微生物生产底盘的构建
为建立高水平ANTA生产的平台菌株，以先前开发的没食子酸过量生产菌株GJ2（本研究中命名为ZW00）为起始宿主（Guo et al., 2024）。该菌株经过工程改造：删除了丙酮酸激酶PykA和PykF以及葡萄糖特异性转运蛋白PtsG，整合了葡萄糖协助扩散系统glf-glk以增强莽草酸途径前体PEP的供应（Lu et al., 2023），并引入抗反馈抑制突变体AroGfbr（D146N）以解除莽草酸途径的反馈抑制（Bo et al., 2023）。将生产质粒pET-lac-trpE fbr-trpG导入ZW00（图2A），获得菌株ZW06。在从头发酵中，ZW06产ANTA 868 mg/L（图2B）。
为阻断竞争途径，我们删除了ZW06中编码预苯酸脱氢酶TyrA和预苯酸脱水酶PheA的基因，消除酪氨酸和苯丙氨酸的积累。由此获得菌株ZW07，ANTA产量提高至1526 mg/L（图2B）。为缓解全局转录调控因子TyrR对莽草酸途径的反馈抑制（Lee et al., 2021），我们敲除tyrR获得菌株ZW08，ANTA产量进一步提高至1890 mg/L（图2B）。接下来我们着眼于提高邻氨基苯甲酸合酶的表达水平以改善ANTA生产。在色氨酸生物合成途径中，邻氨基苯甲酸合酶的α亚基（TrpE）受反馈抑制和严格调控，引入TrpEfbr（S40F）突变体可缓解这一抑制（Liu et al., 2023）。此外，已有报道对yjiP、yciQ和ilvG等假基因位点进行了系统表征，发现其在大肠杆菌中驱动基因表达效率很高（Wang et al., 2024）。因此，本研究选择这些位点进行目标基因整合。将表达盒Plpp4.0-trpE fbr-trpG依次整合至ZW08的yjiP和yciQ位点，获得菌株ZW09和ZW10（图2A）。随着trpE fbr-trpG拷贝数增加，ANTA产量相应提高，ZW10中达到2421 mg/L（图2B）。值得注意的是，发酵液中未检测到莽草酸途径中间体的明显积累，提示前体供应仍是ANTA生产的限制因素。
为解决这一问题，我们加强了莽草酸途径中关键限速酶的表达，包括3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶AroG、3-脱氢奎尼酸合酶AroB和3-脱氢奎尼酸脱水酶AroD（Cheng et al., 2025）。将表达盒Plpp4.2-aroG fbr-aroB-aroD整合至ilvG位点，获得菌株ZW11（图2A），ANTA产量提高至2730 mg/L（图2B）。随后，考虑到充足的氨基供体对ANTA合成必不可少（Mutz et al., 2024），我们在培养基中补充3 g/L谷氨酰胺。在此条件下，ANTA最终产量达到3250 mg/L（图2B），相对原始菌株ZW00提高约3.7倍。为进一步评估工程化ANTA生产底盘在生物反应器条件下的性能，将菌株ZW11在3 L生物反应器中进行补料分批发酵。培养60 h后，ANTA产量达到4940 mg/L（图S2）。这些结果证实，工程菌株在放大培养中保持了ANTA生物合成能力。
【数据】ZW06：868 mg/L；ZW07：1526 mg/L；ZW08：1890 mg/L；ZW10：2421 mg/L；ZW11：2730 mg/L；补加谷氨酰胺后：3250 mg/L（3 g/L谷氨酰胺）；相对ZW00提升：约3.7倍；补料分批60 h：4940 mg/L；突变：AroGfbr D146N、TrpEfbr S40F；整合位点：yjiP、yciQ、ilvG；启动子：Plpp4.0、Plpp4.2
3.2 延伸ANTA生物合成途径生产NMAA
接下来，我们通过筛选高效的N-甲基转移酶，将ANTA生物合成途径延伸至NMAA生产（图3A）。基于文献和数据库挖掘，来自芸香的RgANMT能够催化ANTA甲基化，此前表征其对面邻氨基苯甲酸的Km值为7.1 μM，对SAM的Km值为3.3 μM（Rohde et al., 2007）。此外，我们选取了一组具有相关N-甲基转移酶活性的酶，包括来自兔和人的苯乙醇胺N-甲基转移酶RPNMT和HPNMT（Lee et al., 1978; Wu and McLeish, 2013）、来自咖啡的 xanthine N-甲基转移酶CaXMT1（Kodama et al., 2008）、来自瓜拉纳的PcCS1和PcCS2（Huang et al., 2016）、来自巴拉圭冬青的IPCS1、IPCS2和IPCS3（Vignale et al., 2025）、来自拟南芥的烟酸N-甲基转移酶AT3G53140、来自大豆的NANMT-1（Wang et al., 2026）、来自咖啡的CTgS1（Wang et al., 2026）以及来自罂粟的(S)-乌药碱N-甲基转移酶PsCNMT（Desgagné-Penix and Facchini, 2012）。为评估其催化活性，将这13种候选酶分别导入菌株ZW05，获得菌株ZW12-ZW24。结果显示，仅RgANMT对ANTA表现出可检测活性。具体而言，菌株ZW12积累NMAA 125 mg/L（图3B），其余候选均无 measurable 活性，凸显了该反应的严格底物特异性。
为进一步提高NMAA产量，我们通过改变启动子强度优化RgANMT的表达水平。将原始Plac启动子替换为三个强度递增的启动子（Plac ≈ P2.1 < P3.1 < Plpp2.0，图S1），获得菌株ZW25-ZW27。所有工程菌株的NMAA产量均较ZW12提高。其中携带P2.1启动子的菌株ZW26 NMAA产量最高，达239 mg/L（图3C），提升91%。为验证NMAA产量的改善确由RgANMT表达水平提高所致，采用RT-qPCR分析三个启动子下RgANMT的转录水平。如图3D所示，菌株ZW25-ZW27中RgANMT表达水平分别提高90%、140%和120%，其中P2.1启动子驱动表达水平最高，与观察到的产量趋势一致。尽管如此，前体ANTA仍残留积累1243 mg/L，表明甲基化效率仍是限制因素。
我们随后尝试通过增强甲基供体供应促进甲基化反应。外源补充500 mg/L甲硫氨酸使菌株ZW26在72 h后NMAA产量提高至450 mg/L（图3E），提升88%，证实甲基供体供应是关键限制因素。为避免依赖昂贵的补充剂，我们尝试增强内源SAM的可利用性以提高甲基化效率。已有研究表明，过表达mtn（编码S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶）和luxS（编码S-核糖基同型半胱氨酸裂解酶）可实现SAM从去甲基化SAH的持续再生（Zhou et al., 2022）。因此，我们将质粒pCS-lac-luxS-mtn导入菌株ZW26，获得菌株ZW28。该改造使发酵72 h后NMAA产量提高至524 mg/L（图3F），与甲硫氨酸补充效果相当，较亲本菌株ZW26提升119%。据我们所知，这是目前以大肠杆菌为宿主在摇瓶培养中报道的最高NMAA产量。
【数据】RgANMT：Km(ANTA)=7.1 μM、Km(SAM)=3.3 μM；候选酶：13种；ZW12：125 mg/L；ZW26（P2.1）：239 mg/L（+91%）；转录水平提升：90%、140%、120%；残留ANTA：1243 mg/L；补加甲硫氨酸：500 mg/L→450 mg/L（+88%，72 h）；ZW28：524 mg/L（+119%，72 h）
3.3 延伸ANTA生物合成途径生产3-HAA
为实现3-HAA的从头生物合成，需要一种能将ANTA转化为3-HAA的高效羟化酶（图4A）。我们筛选了一组来自不同来源的羟化酶（图4A），包括来自施氏假单胞菌OX1的苯酚羟化酶phKLMNOPQ（Wang et al., 2018）、来自肺炎克雷伯菌的4-羟基苯乙酸3-羟化酶KpHpaBC、来自铜绿假单胞菌PAO1的PaHpaBC、来自浑浊红球菌B-4的RoHpaBC以及来自大肠杆菌的EcHpaBC（Wang et al., 2022）、来自铜绿假单胞菌的4-羟基苯甲酸羟化酶PobA（Cole et al., 2005），以及来自热脱氮地芽孢杆菌NG80-2的双组分单加氧酶GTNG_3160及其还原酶GTNG_3158（Liu et al., 2010）。为评估其催化活性……
（原文结果部分在此处中断，后续3-HAA筛选数据、共因子供应改造及补料分批发酵结果未在节选中提供。）
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程建立了高效的ANTA微生物生产平台，摇瓶产量3.25 g/L，为目前同类条件下报道的最高水平。在此平台上，通过鉴定有效的N-甲基转移酶RgANMT并优化其表达与甲基供体供应，实现了NMAA的生物合成；同时通过筛选并应用功能性羟化酶GTNG_3160-GTNG_3158，首次实现了由ANTA经单步羟化反应高效合成3-HAA。该工作凸显了工程化平台的多功能性与可扩展性，为ANTA及其高值衍生物的高效微生物生产奠定了坚实基础。
然而，3-HAA合成中关键羟化酶的催化效率在摇瓶和放大条件下仍然有限，构成主要瓶颈。代谢物谱分析虽已确定下游甲基化和羟化反应是主要瓶颈，但未来采用13C代谢通量分析可定量理解胞内碳分布并揭示更多途径优化靶点。后续工作应聚焦于GTNG_3160-GTNG_3158的蛋白质工程改造以提升催化活性，并进一步优化发酵工艺。
编译者解读：该研究的亮点在于"一底盘多衍生物"的平台化思路——先以四轮代谢改造（阻断副产物、增拷贝、强前体、补氨基供体）将ANTA滴度推至3.25 g/L，再以模块化方式接入甲基化或羟化模块，快速衍生NMAA与3-HAA。方法选择上，假基因位点整合与启动子梯度筛选兼顾了表达强度与可预测性。局限同样明显：甲基化与羟化两步的催化效率偏低，NMAA仍残留大量前体，3-HAA的酶活瓶颈在放大条件下未解。对合成生物学而言，下一步的关键不在途径搭建，而在关键酶的定向进化与辅因子再生的精细调控。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102496
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102496