来源：Rational design of chimeric polyhydroxyalkanoate synthases suggests a conserved N-terminal domain-to-LID region network influencing 3HHx incorporation and granule morphology（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
天然PHA合酶底物谱窄，限制了定制共聚物的生产。本研究以两种功能互补的I类PHA合酶——高活性的PhaC Cs与高3HHx掺入能力的PhaCBP-M-CPF4——为亲本，通过生物信息学指导的理性设计构建嵌合酶，16个嵌合体全部具有活性，成功率达100%。部分嵌合体兼具高产率、13.3 mol%的3HHx掺入与单颗粒形态，并提示N端结构域与CAP亚结构域LID区之间存在保守氢键网络，为底物门控机制提供了假设。
研究背景
塑料废弃物造成的微塑料污染已在人体组织中被检出，并与健康风险相关联。聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物合成的可降解聚酯，因可再生、可堆肥、性能可调而被视为石化塑料的替代品。但PHA的工业应用受限于PHA合酶（PhaC）底物专一性窄、聚合效率低——PhaC正是决定聚合物产量、单体组成、分子量与颗粒形态的关键酶。短链PHA如P(3HB)质脆，中链PHA柔韧却热稳定性差、生物合成效率低。天然PhaC底物选择性严格，难以生产兼顾强度与弹性的P(3HB-co-3HHx)等定制共聚物。PhaC工程因此成为研究热点：随机突变需要大文库与繁重筛选，成功案例有限；理性设计虽能产出有用变体，但仍受结构信息不足制约。
研究方法
2.1 菌株、质粒与基因
本研究使用的所有菌株、质粒与核苷酸序列均收录于表S1–S3。phaC Cs与phaC BP-M-CPF4的编码序列由华大基因（中国）合成，并针对C. necator H16进行密码子优化。所有PhaC变体，包括完整、截短与嵌合形式，均采用标准技术克隆至广宿主范围载体pBBR1MCS2中，宿主为E. coli DH5α。所得质粒构建体随后通过E. coli S17–1介导的接合转移导入PHA缺陷宿主C. necator PHB−4。在C. necator PHB−4转化子中，构建的基因受来自C. necator H16的天然phaC1启动子转录控制而表达。E. coli菌株在37 °C的Luria–Bertani（LB）琼脂上培养，C. necator H16、PHB−4及其转化子则在30 °C的胰酪大豆胨 broth（TSB）琼脂上维持。抗生素补充如下：携带构建质粒的E. coli菌株使用50 μg/mL卡那霉素；野生型C. necator H16与PHB−4突变株不加抗生素；接合筛选期间C. necator PHB−4转化子使用300 μg/mL卡那霉素；维持选定的C. necator PHB−4转化子使用50 μg/mL卡那霉素。
【数据】培养基：LB（E. coli）/TSB（C. necator）；温度：37 °C（E. coli）/30 °C（C. necator）；卡那霉素：50 μg/mL（E. coli及维持）、300 μg/mL（接合筛选）；质粒：pBBR1MCS2；启动子：phaC1
2.2 PhaC的生物信息学分析
PhaC Cs（登录号ADL70203.1）、PhaCBP-M-CPF4（登录号AXB72506.1）、Rhodococcus aetherivorans I24的PhaC2（PhaC2 Ra；登录号AED02507.1）与PhaC1 Cn（登录号WP_011615085.1）的蛋白序列自美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取。这些序列及其他研究充分的PhaC的氨基酸序列使用EMBL-EBI Clustal Omega服务器（https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/msa/clustalo）比对，以分析其亲缘关系、序列一致性与两两相似性。所得一致性矩阵用R（v4.4.1）中的Pheatmap函数可视化为热图。PhaC氨基酸序列的系统发育树在Molecular Evolutionary Genetics Analysis 12（MEGA 12）中采用最大似然（ML）算法构建。树拓扑可靠性以1000次bootstrap重复评估，所得树用FigTree软件可视化与最终修饰。为比较PhaC的结构域架构，二级结构用PSIPRED工作台预测，3D模型用Local ColabFold预测。
【数据】序列登录号：ADL70203.1、AXB72506.1、AED02507.1、WP_011615085.1；bootstrap：1000次；软件：MEGA 12、R v4.4.1、PSIPRED、Local ColabFold
2.3 细菌转化子的构建
本研究共使用52株工程菌，其中50株为本研究构建，2株来自先前研究（表S2与S3）。50株新构建菌株中，26株仅含新构建的phaCs基因，另24株含phaCs与来自C. necator H16的phaJ4b Cn基因共表达。本研究所用phaCs包括两个亲本phaCs与25个构建的phaCs，其中9个携带渐进式N端缺失（6个为phaC Cs，3个为phaC BP-M-CPF4），16个为通过互换各亲本酶N端片段创建的嵌合变体。截短与嵌合PhaC设计的详情见3.2节。质粒构建流程见图S1。所有构建质粒均通过E. coli S17–1介导的接合转移导入C. necator PHB−4。转化子经菌落PCR确认，质粒保真性经测序验证。相关菌株与质粒列于表S3，引物序列列于表S4，扩增不同基因或末端区域的引物对列于表S5。
【数据】菌株总数：52株（新构建50株、先前2株）；仅含phaCs：26株；共表达phaJ4b Cn：24株；phaCs总数：27个（亲本2个、构建25个）；截短变体：9个；嵌合变体：16个
2.4 PHA生物合成
构建的菌株首先在尼罗红琼脂平板上筛选功能性PhaC。尼罗红琼脂的制备见Tan等所述。2.3节构建的产PHA的C. necator转化子（见表S3）首先在250 mL锥形瓶中的50 mL TSB培养基中作预培养。当OD₆₀₀达到4.5–5.0时，以3%（v/v）接种量转接至250 mL锥形瓶中的50 mL无机盐培养基（MM）。MM配方基于Budde等。碳源与氮源于接种前即时补充。尿素作氮源，浓度0.054%（w/v）。果糖（2.0%，w/v）、椰子油（CNO；0.7%，w/v）或棕榈油（PO；0.8%或1.2%，w/v）作为唯一碳源加入。这些浓度依据先前研究与预实验选定，以确保充足碳供应、同时最小化生长抑制并保持可比性。培养基中加入卡那霉素（50 mg/L）以保证质粒维持。培养在30 °C、200 rpm振荡下进行48 h。培养结束后收集细胞并冻干用于后续分析。
【数据】接种量：3%（v/v）；OD₆₀₀：4.5–5.0；氮源：尿素0.054%（w/v）；碳源：果糖2.0%、CNO 0.7%、PO 0.8%或1.2%（w/v）；卡那霉素：50 mg/L；温度：30 °C；转速：200 rpm；时间：48 h
2.5 C. necator转化子合成PHA的表征
为测定PHA含量与单体组成，冻干细胞生物质（15–20 mg）按Braunegg等的方法进行酸催化甲醇解。反应在15%（v/v）硫酸与85%（v/v）甲醇的溶液中于100 °C进行140 min。冷却至25 °C后，加入1 mL蒸馏水，混合物剧烈涡旋60 s以诱导相分离。收集含羟酰基甲酯的有机相，用无水硫酸钠脱水。GC–MS分析（Agilent 7890B/5977 A；Agilent Technologies, Inc., USA）时，取0.5 mL衍生化样品与等体积0.2%（v/v）辛酸甲酯（CME）内标混合。分离在HP-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；Agilent Technologies, Inc., USA）上进行，氦气为载气（1.0 mL/min）。柱温程序自40 °C开始（保持1 min），以10 °C/min升至120 °C（保持2 min），再以20 °C/min升至240 °C（保持2 min）。采集质谱并与NIST库比对以鉴定化合物。定量时，对每种单体构建外标曲线：3HB用纯化P(3HB)均聚物，3HHx用P(3HB-co-3HHx)共聚物（3HHx含量由1H NMR测定）。标准品经历相同的甲醇解与GC–MS流程。CME用作内标。准确性用选定样品验证，其GC–MS与1H NMR组成偏差在±1 mol%以内。后续分析中，PHA自冻干细胞以氯仿溶剂萃取法提取，浓度1%（w/v），室温持续搅拌72 h。所得溶液经Whatman® 1级滤纸过滤去除细胞碎片，聚合物随后在冰冷甲醇中沉淀纯化。为解析结构，提取的PHA经1H与13C核磁共振（NMR）波谱分析。1H NMR分析时，将10 mg PHA溶于1 mL氘代氯仿（CDCl3）制样；13C NMR则将50 mg聚合物溶于1 mL CDCl3。所有谱图在Bruker AVANCE III HD 500 MHz波谱仪上采集，四甲基硅烷（Me4Si）为内标。1H NMR分析确认两种单体的掺入，并通过特征峰相对面积计算各单体摩尔分数，确定P(3HB-co-3HHx)共聚物的摩尔组成。共聚物单体序列分布依Bartels等的方法由13C NMR谱评估。
【数据】生物质：15–20 mg；甲醇解：15%硫酸/85%甲醇、100 °C、140 min；相分离：1 mL水、涡旋60 s、25 °C；内标：0.2%（v/v）CME；载气：氦气1.0 mL/min；柱温：40 °C→120 °C（10 °C/min）→240 °C（20 °C/min）；萃取：氯仿1%（w/v）、室温72 h；NMR：10 mg（1H）/50 mg（13C）、500 MHz；准确性：±1 mol%
2.6 P(3HB)颗粒形态的表征
表达天然或工程PhaC变体的C. necator PHB−4转化子所产P(3HB)颗粒的超微结构特征见原文后续（节选至此）。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 PhaC配对的选择依据
PhaC是PHA生物合成的关键酶，在生产多样聚合物方面具有显著工程潜力。Tan等此前报道了若干特性改良的PhaC嵌合体。本研究进一步支持PhaC嵌合化可作为可靠的工程手段这一观点。为此，我们汇编了来自不同类别、表征充分的PhaC清单（表S6），并基于进化关系、序列同源性、结构相似性与功能特征建立选择标准。此外，PhaC嵌合化有望提供进一步证据并阐明N端与C端结构域的具体作用。用ML算法构建PhaC氨基酸序列系统发育树以确定这些PhaC间的进化关系（图1A）。分析揭示四个对应I至IV类的明显分支。有趣的是，PhaC2 Ra虽依其底物专一性（高产3HB）传统上归为I类PhaC，但我们的系统发育分析将其归入与II类酶相同的分支（图1A），而PhaCBP-M-CPF4则与其他I类PhaC聚为一支。与这一系统发育距离一致，我们先前的研究显示以PhaC2 Ra为C端亲本构建的嵌合体成功率极低，进一步表明PhaC2 Ra与I类PhaC之间结构兼容性差。因此，PhaC2 Ra被认为不适合与PhaCBP-M-CPF4或其他I类PhaC配对，被排除在进一步考虑之外。核苷酸序列一致性分析给出了一致的聚类结果（图S2）。
接着我们计算了所有PhaC间的氨基酸序列一致性（图1B）。该分析确认了同样的四组聚类，并为我们的选择提供了定量支持。结构域特异性一致性矩阵见图S3。我们最初假设，PhaC酶的成功嵌合将因高序列同源性而更易实现，尤其是在C端结构域。然而，亲本酶之间的功能差异性同样关键，因为目标是将 divergent 谱系中互补的有益性状结合起来。这些性状包括底物专一性、产量、聚合物分子量与颗粒形态。这种功能反差的要求使高度相似的I类配对PhaC Cs与PhaC As（序列一致性78%，图1B）不适合作为主要搭档。依据现有文献，这两种酶在底物专一性、酶活性、聚合物分子量或颗粒形态上并无实质分化。因此，它们不被期望提供嵌合化所需的功能反差。我们因而聚焦于总体同源性较低但已知具有互补性状的配对。相比之下，其他I类配对仅共享38–46%的一致性（图1B），使78%显著偏高。此外，为能与先前工作直接比较，我们选择PhaCBP-M-CPF4或PhaC2 Ra之一作为亲本。PhaCBP-M-CPF4最终因其与其他I类PhaC更近的进化关系与更高的序列相似性而入选。值得注意的是，先前工作报道保留PhaCBP-M-CPF4 C端结构域的嵌合体表现出更优的单颗粒形态。尽管本研究仅聚焦N端互换，这一先前观察进一步支持选择PhaCBP-M-CPF4作为亲本酶，因为其C端结构域（在我们所有嵌合体中保持完整）可能对颗粒形态有有利贡献。II类PhaC在系统发育上与PhaCBP-M-CPF4距离更远（图1A），故未被视为直接嵌合搭档。III类与IV类PhaC因缺乏I类与II类PhaC所具有的延伸NTD而被排除在嵌合化之外（图S4）。因此，另一亲本从剩余I类PhaC中选择。鉴于PhaCBP-M-CPF4体外酶活性较低但3HHx单体掺入中等偏高，需要一个功能特性相反的搭档。PhaC Cs因其高体外酶活性与低3HHx掺入倾向而满足这一需求。最终，PhaCBP-M-CPF4与PhaC Cs被选为嵌合配对。
【数据】序列一致性：PhaC Cs与PhaC As为78%；其他I类配对38–46%；系统发育树：ML、1000 bootstrap；PhaC2 Ra归入II类分支
3.2 截短与嵌合PhaC酶的设计
我们以Aeromonas caviae PhaC（PhaC Ac，PDB: 9KNK）晶体结构为模板，用ColabFold对PhaCBP-M-CPF4与PhaC Cs进行二级结构与3D建模。预测模型显示PhaCBP-M-CPF4的NTD含八个螺旋（BPα1–BPα8），而PhaC Cs具九个（CSα1–CSα9）。与已知PhaC Ac结构一致，两个模型的NTD中均未发现β链元件（图2A–C）。PhaC的NTD关键影响底物专一性、聚合物分子量、二聚化与颗粒形成。相反，C端结构域采取紧凑的α/β水解酶折叠，含PHA聚合的必需元件，包括催化三联体与底物通道。两个结构域对活性均不可或缺，删除任一即废除聚合。这种二分架构为工程嵌合PhaC提供了结构基础。我们因而聚焦于互换N端α螺旋区域，同时保持C端α/β水解酶核心结构域完整。避免互换C端片段，是因为先前研究一致产生无功能酶，表明C端结构域的结构完整性对破坏高度敏感。设计的截短与嵌合体示意概览见图2D（简化表示）；带α螺旋与β链注释的更详细结构域架构见图S5。总计，我们通过在两亲本酶间互换确定的N端片段，构建了9个截短与16个嵌合PhaC构建体。嵌合体命名为CSBP系列（PhaC Cs N端+PhaCBP-M-CPF4 C端）与BPCS系列（反向）。完整设计策略，包括序列比对、二级结构预测、片段边界定义与基于环连接的理由，见图2并在补充方法中详述（方法描述见图S5）。为生成用于评估N端功能互补的部分受损基线对照，我们构建了PhaC Cs与PhaCBP-M-CPF4的N端截短变体（见图2D与S5）。所有构建体在相同条件下于C. necator中表达。为确保评估3HHx掺入所需的充足单体供应，(R)-特异性烯酰辅酶A水合酶PhaJ4b Cn自同一质粒共表达。
【数据】NTD螺旋数：PhaCBP-M-CPF4为8个（BPα1–BPα8）、PhaC Cs为9个（CSα1–CSα9）；模板：PhaC Ac（PDB: 9KNK）；构建体：截短9个、嵌合16个；嵌合系列：CSBP、BPCS
3.3 全长PhaCBP-M-CPF4及其N端截短变体的PHA生产
PhaCBP-M-CPF4的三个截短变体（27–551、54–551与69–551）在尼罗红琼脂筛选中保留PHA合成活性（图S6），被选用于体内研究。全长酶用作对照。在所有测试碳源下，全长酶显示最高PHA滴度与最高3HHx分数（图3A–D）。去除第一个N端α螺旋（变体27–551）在以果糖或PO为唯一碳源时未显著降低PHA滴度。然而，以CNO为碳源时观察到显著下降，变体27–551仅保留全长滴度的57.9%（表S7）。CNO含较高比例的短链脂肪酸（如C12），已知会损害C. necator PHB−4的生长。这种受损的细胞适应度似（节选至此）。
【数据】截短变体：27–551、54–551、69–551；CNO条件下27–551滴度：全长的57.9%；碳源：果糖2.0%、PO 1.2%/0.8%、CNO 0.7%（w/v）
讨论与解读
本研究提出并支持一套用于理性设计功能性嵌合PhaC的生物信息学兼容性标准。16个嵌合体100%的活性成功率彰显了该框架的预测力：亲本兼容性越高，直接增加创建兼具杂合有益性状的功能酶的概率。通过结构域互换与截短，我们进一步提示催化结构域主要影响3HHx掺入与颗粒形态，而NTD对二者起调节作用。关键的是，我们提出一个连接NTD与CAP亚结构域LID区的保守氢键网络，该特征为四个远缘相关的I类与II类PhaC所共享。该网络被提出仅由NTD最后三个α螺旋形成，并在二聚化与LID门控的耦合中起作用；其破坏被提出会损害LID移动性、限制底物通道并选择性排除3HHx-CoA等 bulky 单体。由于III类与IV类PhaC缺乏延伸NTD，该模型目前限于I类与II类酶。III类与IV类PhaC是否通过其他亚结构域运行类似的远端互作网络，仍是开放问题，值得未来研究。需注意，本研究仅考察了3HB与3HHx的掺入；所提出的NTD–LID网络是否也支配其他单体的掺入仍有待探索。
编译者解读：该研究的价值在于把"能不能嵌合"从试错变成可计算的配对问题——用进化距离、序列一致性与功能反差三条标准筛亲本，16/16的活性率是硬证据。方法上，仅互换N端α螺旋而保留C端水解酶核心，规避了此前C端互换普遍失活的陷阱。局限也明显：NTD–LID氢键网络目前只是ColabFold模型提出的机制假设，缺乏突变验证与结构解析；且结论仅覆盖I、II类酶与3HB/3HHx两种单体。对合成生物学而言，这提供了一个可移植的嵌合设计流程与一个潜在的变构改造靶点。
参考来源
International Journal of Biological Macromolecules, 2026
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154671
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154671