来源：Study on Quality and Flavor Changes of Bacillus subtilis Fermented Zao Chili Based on Metabolomics and GC-MS Analysis（International Journal of Gastronomy and Food Scien）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
糟辣椒是贵州传统发酵调味品，自然发酵存在周期长、批次品质不稳定等缺陷。本研究以GRAS益生菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis CICC DC-15）对糟辣椒进行控制接种发酵，系统比较了接种发酵（BF）与自然发酵（CK）在酸化能力、色泽稳定性、酚类与抗坏血酸保留、辣椒素降解、抗氧化与降血糖活性及挥发性风味等方面的差异。结合广泛靶向代谢组学与HS-SPME-GC-MS，研究揭示接种发酵显著上调黄酮/黄酮醇生物合成通路、抑制辣椒素合成通量，并定向优化了酯类与萜类香气轮廓，为传统发酵蔬菜的品质升级提供了益生菌技术策略。
研究背景
糟辣椒是黔菜标志性发酵调味品，以酸鲜风味和丰富营养成分为消费者所青睐。传统自然发酵虽能形成其独特风味，但发酵周期长、批次间品质波动明显。人工接种发酵则可加速发酵效率、稳定产品质量、抑制腐败微生物增殖、缓解类胡萝卜素降解、保留总酚类物质与抗氧化能力，并定向调控目标风味代谢物的生成。目前发酵辣椒中应用的主导菌株包括植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和库德里阿兹威毕赤酵母（Komagataella phaffii）。枯草芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性菌，属于GRAS益生菌株，对食品基质组分具有强大的生物转化能力。它能分泌多种胞外水解酶（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶），分解大分子底物并驱动整个发酵过程中的代谢物转化。前期研究已验证其在发酵豆渣中的应用价值。
研究方法
2.1 菌株活化与样品制备
#### 2.1.1 菌株活化
实验所用菌株为枯草芽孢杆菌CICC DC-15，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。菌株首先在液体LB培养基中于37 °C活化24 h，获得一级种子液。随后在梯度辣椒汁培养基（20%、50%、100%辣椒汁，v/v）中连续传代三次进行适应性驯化，强化菌株对辣椒发酵基质的耐受性。驯化完成后，通过冷冻离心（4 °C，5,000 rpm，8 min）收集菌体沉淀，用无菌生理盐水洗涤两次，重悬制备终浓度为1 × 10⁷ CFU/mL的种子悬液，用于后续接种。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌CICC DC-15；培养基：液体LB培养基；温度：37 °C；时间：24 h；驯化梯度：20%、50%、100%辣椒汁（v/v）；传代次数：3次；离心条件：4 °C、5,000 rpm、8 min；洗涤液：无菌生理盐水；种子悬液浓度：1 × 10⁷ CFU/mL
#### 2.1.2 样品制备
原料：完整、无虫害的成熟二荆条新鲜红辣椒；生姜、大蒜、食用盐和红星二锅头白酒均购自贵州省贵阳市当地农贸市场。辣椒用自来水冲洗并充分沥干，随后去蒂切碎。将切碎的辣椒转入密封发酵罐中，加入辅料（生姜4%、大蒜4%、盐8%、白酒6%，均为辣椒原料的质量分数）并充分混匀。BF组接种4%（w/w）枯草芽孢杆菌种子悬液，CK组则加入等体积无菌生理盐水进行自然自发发酵。所有发酵罐置于恒温室温（25 °C）下储存，相对湿度维持在70%–80%。罐盖覆盖，并向边缘水槽注水形成水封单向排气结构，使发酵产生的CO₂逸出，同时防止外部空气和杂菌进入发酵体系。总发酵周期为25天。每组设三个生物学重复，每个重复含三个独立发酵罐。在发酵第0、5、10、15、20和25天采集代表性混合样品，通过混合各罐等量辣椒浆以消除单罐偏差。所有采集样品装入无菌离心管，于−80 °C储存用于后续指标检测。
【数据】原料：二荆条新鲜红辣椒；辅料：生姜4%、大蒜4%、盐8%、白酒6%（质量分数）；接种量：4%（w/w）；温度：25 °C；湿度：70%–80%；发酵周期：25天；生物学重复：3组，每组3个发酵罐；采样时间点：第0、5、10、15、20、25天；储存温度：−80 °C
2.2 理化分析
#### 2.2.1 pH、总滴定酸、还原糖与色泽测定
样品pH使用校准后的便携式pH计（ST2100，奥豪斯仪器，常州，中国）直接测定。总滴定酸按中国国家标准GB 12456-2021通过酸碱中和滴定法测定。还原糖含量采用DNS比色法量化。色泽参数L（亮度）、a（红绿色度）、b*（黄蓝色度）使用NR60CP色差仪测定，以标准白板为校准参考。总色差ΔE按Pathare等人（2013）提出的公式计算：ΔE = √[(a−a₀)² + (b−b₀)² + (L−L₀)²]，其中L₀、a₀、b₀代表白色校准标准的色泽参数。
【数据】pH计型号：ST2100（奥豪斯仪器，常州，中国）；总滴定酸标准：GB 12456-2021；还原糖方法：DNS比色法；色差仪型号：NR60CP；总色差公式：ΔE = √[(a−a₀)² + (b−b₀)² + (L−L₀)²]
#### 2.2.2 总酚与总黄酮含量测定
糟辣椒总酚含量（TPC）采用He等人（He, Liu, Hua, Singh, & Lu, 2025）报道的改良Folin-Ciocalteu法测定。尽管该方法广泛用于酚类定量，但存在固有局限：Folin-Ciocalteu试剂与所有还原性物质反应而非特异性针对酚类，产生检测干扰；反应温度、时间和pH波动也会改变吸光度值（Raposo, Borja, & Gutierrez-Gonzalez, 2024）。本研究在严格统一所有样品的反应条件以保证数据可比性，尽管存在上述缺陷。总黄酮含量（TFC）参照Ochieng等人（Ochieng et al., 2022）描述的方案稍作修改后测定。
【数据】总酚方法：改良Folin-Ciocalteu法；总黄酮方法：参照Ochieng et al. (2022)方案修改；原文未详述具体试剂用量与反应条件
#### 2.2.3 抗坏血酸与辣椒素类物质定量
抗坏血酸含量参照GB 5009.86-2016（中国食品安全国家标准）中规定的方法三检测。辣椒素类物质检测前处理：准确称取糟辣椒样品，于60 °C干燥并研磨成细粉。简言之，将0.05 g辣椒粉与5 mL甲醇混合，随后于35 °C超声提取30 min。收集上清液，残渣再用新鲜甲醇重新提取一次。合并的甲醇提取液在温和氮气流下吹干，用0.5 mL甲醇复溶，并通过有机针式过滤器过滤后用于HPLC分析。HPLC分离条件：C18色谱柱（200 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-水（60:40，v/v）；流速1.0 mL/min；柱温30 °C；检测波长280 nm；进样体积10 μL。
【数据】干燥温度：60 °C；样品量：0.05 g；提取溶剂：5 mL甲醇；超声温度：35 °C；超声时间：30 min；复溶体积：0.5 mL甲醇；色谱柱：C18（200 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（60:40，v/v）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 °C；检测波长：280 nm；进样体积：10 μL
#### 2.2.4 体外抗氧化与降血糖活性评价
抗氧化能力测定：采用商业试剂盒（上海垚智检测技术有限公司）按试剂盒说明书测定DPPH、ABTS和羟自由基清除率。总抗氧化能力（T-AOC）通过快速ABTS试剂盒评价，结果以Trolox等效抗氧化能力表示。降血糖活性通过α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性表征，按De Bellis等人（De Bellis et al., 2022）的方法测定。
【数据】试剂盒来源：上海垚智检测技术有限公司；抗氧化指标：DPPH、ABTS、羟自由基清除率、T-AOC；T-AOC表达方式：Trolox等效抗氧化能力；降血糖指标：α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性；方法来源：De Bellis et al., 2022
2.3 广泛靶向代谢组学分析
#### 2.3.1 代谢组样品前处理
准确称取25 mg冻干辣椒样品，在液氮下充分研磨（40 Hz，40 s）。加入1 mL含内标（1 mg/mL 2-氯-L-苯丙氨酸）的80%甲醇水溶液，涡旋30 s，冰浴孵育6 min。混合物于12,000 rpm、4 °C离心5 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤后用于UPLC-ESI-QTRAP-MS/MS检测。
【数据】样品量：25 mg；研磨条件：液氮、40 Hz、40 s；提取液：1 mL 80%甲醇水溶液；内标：1 mg/mL 2-氯-L-苯丙氨酸；涡旋时间：30 s；冰浴时间：6 min；离心条件：12,000 rpm、4 °C、5 min；滤膜孔径：0.22 μm
#### 2.3.2 色谱与质谱参数
UPLC系统：EXION LC UPLC，配备Kinetex C18色谱柱（2.10 × 100 mm，2.60 μm）。流动相A：0.1%乙酸水溶液；流动相B：乙腈-异丙醇混合溶液（1:1，v/v）。梯度洗脱程序：0–9 min，B相从5%线性升至95%；9–10 min，维持95% B；10–11 min，B相线性降至5%；11–14 min，维持5% B。流速0.3 mL/min，柱温25 °C，进样体积2 μL。质谱参数：ESI离子源，源温400 °C；正离子模式电压+5500 V，负离子模式−4500 V；雾化气（GSI）50 psi，辅助加热气（GSII）60 psi，帘气（CUR）35 psi；碰撞诱导解离（CAD）设为高能量模式。
【数据】色谱柱：Kinetex C18（2.10 × 100 mm，2.60 μm）；流动相A：0.1%乙酸水溶液；流动相B：乙腈-异丙醇（1:1，v/v）；梯度：0–9 min 5%→95% B，9–10 min 95% B，10–11 min 95%→5% B，11–14 min 5% B；流速：0.3 mL/min；柱温：25 °C；进样体积：2 μL；源温：400 °C；正离子电压：+5500 V；负离子电压：−4500 V；GSI：50 psi；GSII：60 psi；CUR：35 psi；CAD：高能量模式
#### 2.3.3 代谢物定性定量分析
代谢物鉴定通过将保留时间、质荷比和二级碎片谱图与自建BiotreeDB数据库（百趣生物，上海）匹配完成。质谱采集在MRM模式下进行，以氮气为碰撞气，采用中等碰撞能量。每个离子对的去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）均单独优化。定量计算依据产物离子（Q3）信号强度，而前体离子（Q1）、Q3、保留时间、DP和CE值联合用于代谢物的定性确证。
【数据】数据库：BiotreeDB（百趣生物，上海）；采集模式：MRM；碰撞气：氮气；碰撞能量：中等；定量依据：产物离子（Q3）信号强度；定性依据：Q1、Q3、保留时间、DP、CE
2.4 HS-SPME-GC-MS挥发性风味化合物分析
#### 2.4.1 顶空固相微萃取挥发性物质提取
挥发性物质采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME纤维（Supelco，美国）捕集。将1 g切碎辣椒样品、3 mL饱和NaCl溶液和50 μL内标（8.22 mg/L 2-辛醇）加入顶空瓶中，于70 °C平衡15 min。将SPME纤维暴露于瓶顶空，于70 °C吸附挥发性物质40 min。萃取完成后，将纤维插入……
【数据】SPME纤维：50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Supelco，美国）；样品量：1 g；饱和NaCl溶液：3 mL；内标：50 μL 8.22 mg/L 2-辛醇；平衡温度：70 °C；平衡时间：15 min；吸附温度：70 °C；吸附时间：40 min
研究结果
3.1 发酵过程中产酸、还原糖变化与色泽稳定性
所有样品的总滴定酸在整个发酵过程中持续增加，并在发酵15天后达到动态平衡。如图1A和1B所示，接种枯草芽孢杆菌的BF组在所有采样时间点均比CK自然发酵组消耗更多还原糖，并表现出更强的产酸能力，第15天至第20天之间观察到显著的组间差异（p < 0.05）。在第25天（发酵终点），BF的总滴定酸达到2389 mg/100 g，显著高于CK（2223 mg/100 g，p < 0.05）。同时，BF的还原糖含量（2.54%）显著低于CK（2.89%，p < 0.05）。如图1C所示，糟辣椒的总色差ΔE随发酵时间延长而上升，而枯草芽孢杆菌接种有效减缓了色素降解并减轻了褪色。发酵终止时，CK的色泽变化率为130.93%，而BF仅为99.13%（p < 0.05）。总之，枯草芽孢杆菌辅助发酵加速了还原糖分解代谢，促进了有机酸积累并改善了糟辣椒的色泽保持。这些表型变异与菌株接种密切相关，但具体代谢调控机制以及外源枯草芽孢杆菌与土著微生物菌群的各自贡献比例仍需进一步针对性验证。
【数据】总滴定酸（BF，第25天）：2389 mg/100 g；总滴定酸（CK，第25天）：2223 mg/100 g；还原糖（BF，第25天）：2.54%；还原糖（CK，第25天）：2.89%；色泽变化率（CK）：130.93%；色泽变化率（BF）：99.13%；显著性：p < 0.05；达平衡时间：15天
3.2 总酚、黄酮、抗坏血酸与辣椒素类物质的动态变化
微生物去糖基化可分解糖基化酚类前体，促进植物细胞壁结构中嵌入的可溶性结合态和不溶性结合态酚类的释放（Benincasa, Muccilli, Amenta, Perri, & Romeo, 2015）。两组的总酚含量在发酵过程中逐渐下降（图2A）。第25天时，BF保留了47.30 mg GAE/100 g总酚，显著高于CK（35.45 mg GAE/100 g，p < 0.05）。总黄酮呈现相反的变化趋势（图2B）：黄酮水平在整个发酵周期持续增加，第25天时BF达到34.60 mg RE/100 g，而CK为25.20 mg RE/100 g（p < 0.05）。现有文献报道枯草芽孢杆菌分泌纤维素酶降解细胞壁多糖，促进胞内生物活性物质的溶出（Chen, Xing, Huang, & Xu, 2011; Gao, Fan, Tan, & Fu, 2025; Lee, Min, Wang, Gupta, & Kim, 2026）。BF中更高的黄酮浓度与该推断相符；然而，本实验未定量检测纤维素酶活性和细胞壁降解程度，因此上述机制推演仍基于文献，需要直接实验验证。抗坏血酸含量在所有发酵样品中逐渐下降，但BF的保留率显著优于CK（图2C）。发酵结束时，BF的抗坏血酸浓度为84.63 mg/100 g，而CK为68.25 mg/100 g（p < 0.05），证明枯草芽孢杆菌接种有效缓解了维生素C的氧化损失。辣椒素类物质是辣椒的核心辛辣特征成分；其含量随发酵时间持续下降，BF组降解速率更快（图2D）。发酵25天后，BF的辣椒素类物质降解率达87.30%，明显高于CK（76.11%，p < 0.05）。简言之，枯草芽孢杆菌接种减少了抗坏血酸氧化损失并加速了辣椒素类物质分解代谢，降低了糟辣椒的辛辣刺激感，同时保留了更多抗氧化酚类和黄酮组分。
【数据】总酚（BF，第25天）：47.30 mg GAE/100 g；总酚（CK，第25天）：35.45 mg GAE/100 g；总黄酮（BF，第25天）：34.60 mg RE/100 g；总黄酮（CK，第25天）：25.20 mg RE/100 g；抗坏血酸（BF）：84.63 mg/100 g；抗坏血酸（CK）：68.25 mg/100 g；辣椒素降解率（BF）：87.30%；辣椒素降解率（CK）：76.11%；显著性：p < 0.05
3.3 抗氧化能力与降血糖活性分析
#### 3.3.1 体外抗氧化活性评价
超氧自由基是引发机体氧化衰老的主要物质，其清除效率是反映抗氧化性能的核心指标（Dose et al., 2016）。与CK相比，BF组在多种自由基清除能力上表现出显著提升（图3A）：DPPH自由基清除率提高26.40%，T-AOC总抗氧化能力上升10.81%，ABTS自由基清除活性提高3.40%，羟自由基清除能力最大增幅达51.42%。所有组间差异均达到统计学显著性（p < 0.05）。总体而言，枯草芽孢杆菌接种发酵显著增强了糟辣椒产品的综合抗氧化活性。
【数据】DPPH清除率增幅：26.40%；T-AOC增幅：10.81%；ABTS增幅：3.40%；羟自由基清除能力最大增幅：51.42%；显著性：p < 0.05
#### 3.3.2 碳水化合物水解酶抑制表征的降血糖活性
测定α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性以评估发酵糟辣椒的潜在降血糖功能。如图3A所示，BF对两种碳水化合物消化酶均表现出更强的抑制作用。α-淀粉酶抑制率从23.52 ± 0.32%（CK）提高至32.00 ± 0.34%（BF），提升幅度为36.05%（p < 0.01）。α-葡萄糖苷酶抑制活性从36.43 ± 0.14%增强至41.43 ± 0.18%，增长幅度为13.72%（p < 0.05）。结果表明，枯草芽孢杆菌发酵糟辣椒能有效抑制淀粉和多糖分解，赋予产品更优的营养与功能价值。
【数据】α-淀粉酶抑制率（CK）：23.52 ± 0.32%；α-淀粉酶抑制率（BF）：32.00 ± 0.34%；α-淀粉酶抑制提升幅度：36.05%；α-葡萄糖苷酶抑制活性（CK）：36.43 ± 0.14%；α-葡萄糖苷酶抑制活性（BF）：41.43 ± 0.18%；α-葡萄糖苷酶抑制增长幅度：13.72%；显著性：p < 0.01（α-淀粉酶）、p < 0.05（α-葡萄糖苷酶）
3.4 生物活性化合物与功能特性的相关性
采用相关性热图分析（Origin 2024）揭示BF糟辣椒特征生物活性成分与功能活性之间的内在关系（图3B）。热图中蓝色代表负相关，红色代表正相关，椭圆伸长程度反映相关强度。总酚、黄酮和抗坏血酸与DPPH/ABTS/羟自由基清除能力、T-AOC、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性均呈显著正相关（p < 0.05），其中黄酮的相关系数最强。相反，辣椒素类物质含量与所有功能指标呈显著负相关（p < 0.01）。可以得出结论：酚类、黄酮和抗坏血酸的协同积累共同增强了枯草芽孢杆菌发酵后糟辣椒的抗氧化和降血糖生物活性，而辣椒素降解进一步促进了功能性能的提升。
【数据】正相关指标：总酚、黄酮、抗坏血酸与DPPH/ABTS/羟自由基清除、T-AOC、α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性；最强相关系数：黄酮；负相关：辣椒素类物质与所有功能指标（p < 0.01）；显著性：p < 0.05（正相关）
3.5 广泛靶向代谢组学分析
#### 3.5.1 PCA与OPLS-DA多元判别分析
通过UPLC-ESI-QTRAP-MS/MS结合BiotreeDB数据库共鉴定并定量了458种代谢物。这些代谢物被分为八大类（图4A饼图）：莽草酸和苯丙素类（147种，32.10%）、生物碱（86种，18.80%）、萜类（72种，15.70%）、氨基酸及其衍生物（40种，8.70%）、其他代谢物（39种，8.50%）、脂肪酸（28种，6.10%）、聚酮类（25种，5.50%）、碳水化合物（21种，4.60%）。PCA得分图（图4B）显示BF与CK组代谢轮廓完全分离。PC1和PC2累计解释61.39%的总样本方差，组内聚集紧密，组间象限分布明显，验证了不同发酵方式诱导的显著代谢差异。OPLS-DA判别模型（图4C）实现了优异的拟合和预测性能：R²X=0.62，R²Y=0.99，Q²=0.94。置换检验和CV-ANOVA结果确认模型无过拟合，进一步证明两种发酵处理间存在显著差异代谢物积累。
【数据】鉴定代谢物总数：458种；莽草酸和苯丙素类：147种（32.10%）；生物碱：86种（18.80%）；萜类：72种（15.70%）；氨基酸及衍生物：40种（8.70%）；其他：39种（8.50%）；脂肪酸：28种（6.10%）；聚酮类：25种（5.50%）；碳水化合物：21种（4.60%）；PC1+PC2累计方差：61.39%；OPLS-DA：R²X=0.62，R²Y=0.99，Q²=0.94
#### 3.5.2 显著差异代谢物筛选
基于三个联合阈值筛选差异代谢物：OPLS-DA VIP > 1.50、p值 < 0.05、倍数变化FC > 2或FC < 0.50。火山图（图5A）可视化了BF与CK之间代谢物丰度变化。总体而言，共筛选出69种显著差异代谢物。
【数据】差异代谢物筛选阈值：VIP > 1.50、p < 0.05、FC > 2或FC < 0.50；显著差异代谢物总数：69种
讨论与解读
与自然自发发酵相比，GRAS益生菌枯草芽孢杆菌接种发酵显著促进了糟辣椒中总酚、总黄酮和抗坏血酸的积累，这些生物活性物质的富集与体外抗氧化和降血糖生物活性的提升呈正相关。广泛靶向代谢组学结果揭示，枯草芽孢杆菌处理显著上调了苯丙素代谢网络中的黄酮和黄酮醇生物合成通路，同时竞争性抑制了辣椒素生物合成通量，导致BF组中黄酮丰度更高、辣椒素类物质含量更低。HS-SPME-GC-MS挥发性风味分析表明，酯类和萜类是核心差异香气成分；与CK自然发酵相比，枯草芽孢杆菌接种产生了28种额外挥发性化合物。有益风味物质（水杨酸甲酯、乳酸乙酯、萜品油烯、棕榈酸乙酯）显著上调，而刺激性不良风味前体（异戊醇、异丁醇、二烯丙基二硫醚）下调，实现了糟辣椒香气的定向优化。电子舌、电子鼻和模糊数学感官评价共同验证，接种发酵提升了酸味和鲜味丰富度，抑制了苦味和辛辣味，改善了产品的整体感官可接受性。代谢组学、GC-MS挥发性检测和KEGG……
编译者解读
该研究以GRAS益生菌枯草芽孢杆菌对传统糟辣椒进行控制接种发酵，方法选择上兼顾了菌株对辣椒基质的梯度驯化与实际发酵验证，路径清晰。其价值在于用代谢组学与GC-MS联用将“风味改善”这一模糊感官概念落到具体代谢物与通路层面——黄酮/黄酮醇通路上调与辣椒素合成抑制的竞争关系尤其具有调控意义。局限在于纤维素酶活性与细胞壁降解程度未定量检测，外源菌与土著菌群的贡献比例也未拆分，机制推演仍依赖文献。若能将关键酶活与菌群演替数据纳入，该策略的可控性会更强。
参考来源
期刊：International Journal of Gastronomy and Food Science, 2026
DOI: 10.1016/j.ijgfs.2026.101667
DOI: 10.1016/j.ijgfs.2026.101667