来源：High-level bioproduction of L-theanine by systematically engineered Escherichia coli without ethylamine feeding（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-茶氨酸是茶叶中含量最丰富的游离氨基酸，广泛应用于食品、化妆品和医药领域。传统微生物发酵法依赖外源添加有毒的乙胺作为底物，制约了其绿色工业化进程。本研究在大肠杆菌中系统构建了双路径乙胺胞内合成体系，通过优化L-茶氨酸合成酶MmGMAS表达、阻断降解途径、强化前体供给、开发脱羧与转氨两条乙胺合成路径，并结合乙醛耐受性适应性进化，最终工程菌株THE-17在补料分批发酵中实现118.2 g/L的L-茶氨酸产量，为目前报道最高水平。
研究背景
L-茶氨酸（γ-谷氨酰乙胺）是一种来源于茶树的非蛋白质氨基酸，赋予茶叶独特的鲜味，直接影响茶叶品质与价格。除风味贡献外，L-茶氨酸具有促进放松、降低血压、改善认知、保护神经元和增强免疫等多种健康功效，已被美国FDA认定为公认安全物质（GRAS）。这些健康益处和安全性使其在食品、化妆品和制药行业得到广泛应用，年需求量持续攀升。
目前L-茶氨酸的生产方法包括从茶叶中提取、化学合成、酶法合成和添加乙胺的微生物发酵法。L-茶氨酸占绿茶和红茶游离氨基酸总量的40–70%，但仅占茶叶干重的1–2%，因此分离高纯度天然L-茶氨酸通常耗时且成本高昂。化学合成虽然简单、经济且产率高，但所得产物为外消旋混合物，且涉及有毒试剂。酶法合成和添加乙胺的发酵法虽然效率较高，但均依赖外源添加乙胺——一种易燃、腐蚀性强且具有刺激性的危险化学品，不仅增加生产成本，还带来安全和环境隐患。因此，开发无需外源乙胺添加的L-茶氨酸高效生物合成策略具有重要的工业应用价值。
研究方法
2.1 菌株、质粒和引物
本文所用菌株见表1。本研究所用质粒、引物和gRNA寡核苷酸见补充表1和表2。大肠杆菌DH5α用于质粒构建。高拷贝质粒pTrc用于过表达关键基因。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α（质粒构建）；质粒：pTrc（高拷贝过表达载体）；引物/gRNA：见补充表1和表2；原文未详述具体引物序列
2.2 遗传操作
质粒pTrc通过EcoRI和XbaI双酶切线性化，用于构建过表达质粒。以pTrc-E-P质粒为例，eutE基因使用引物对pTrc-E-P-UF/pTrc-E-P-UR扩增，PpspuC基因使用引物对pTrc-E-P-DF/pTrc-E-P-DR扩增。RBS设计在引物的同源臂内。扩增片段使用ClonExpress II一步克隆试剂盒（诺唯赞生物，南京，中国）连接至线性化载体，生成重组质粒pTrc-E-P。
来自Methylovorus mays、Methyloversatilis universalis和Methylobacterium extorquens的gmas基因[12]；来自Bifidobacterium adolescentis的Baxfp基因；来自Mannheimia succiniciproducens的MspckA基因；来自Zymomonas mobilis的Zmpdc基因；来自Pseudomonas putida的PpspuC基因；来自C. sinensis的CsalaDC基因均由GENEWIZ公司（苏州，中国）合成并针对大肠杆菌表达进行密码子优化。BsalaDH基因从Bacillus subtilis 168中克隆。其余基因从大肠杆菌基因组中扩增，并与各自的上游和下游同源臂组装用于基因组编辑。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑使用质粒pRED-Cas9和pGRB进行靶基因的整合或敲除[30]。
【数据】限制性内切酶：EcoRI、XbaI；克隆试剂盒：ClonExpress II一步克隆试剂盒（诺唯赞）；gmas基因来源：M. mays、M. universalis、M. extorquens；Baxfp来源：B. adolescentis；MspckA来源：M. succiniciproducens；Zmpdc来源：Z. mobilis；PpspuC来源：P. putida；CsalaDC来源：C. sinensis；BsalaDH来源：B. subtilis 168；基因合成公司：GENEWIZ（苏州）；基因组编辑系统：CRISPR/Cas9（pRED-Cas9和pGRB质粒）；原文未详述酶切温度和时间
2.3 摇瓶发酵
将工程菌株接种至含5 mL LB培养基的试管中，37 °C培养12 h。随后将培养物转接至含30 mL种子培养基的500 mL挡板摇瓶中，37 °C、220 rpm振荡培养至600 nm光密度（OD600）达到15。之后以10%（v/v）接种量转接至含30 mL发酵培养基的500 mL挡板摇瓶中，37 °C、220 rpm培养24 h。定期取样1 mL用于后续分析。细胞生长、葡萄糖和氨基酸的测定参照先前研究所述方法[12,30,31]。所有发酵实验均进行三次平行。
种子培养基含30 g/L葡萄糖、3 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、1.2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4、10 mg/L FeSO4、10 mg/L MnSO4、1.3 mg/L维生素B1,3,5,12、1 mg/L维生素H和8 mg/L酚红（pH调至7.0–7.2）。
发酵培养基含25 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、4 g/L酵母提取物、2 g/L KH2PO4、2 g/L MgSO4、2 g/L柠檬酸钠、20 mg/L FeSO4、10 mg/L MnSO4、2 mg/L维生素B1,3,5,12、2 mg/L维生素H和8 mg/L酚红（pH调至7.0–7.2）。酚红用作pH指示剂，添加25%（v/v）氨水维持pH约7.0。补料分批培养使用60%（w/v）葡萄糖溶液作为补料底物。同时，每3 h补充5 mL乙胺盐酸盐（16%，m/v）。
【数据】种子培养基：30 g/L葡萄糖、3 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、1.2 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4、10 mg/L FeSO4、10 mg/L MnSO4、1.3 mg/L维生素B1,3,5,12、1 mg/L维生素H、8 mg/L酚红，pH 7.0–7.2；发酵培养基：25 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、4 g/L酵母提取物、2 g/L KH2PO4、2 g/L MgSO4、2 g/L柠檬酸钠、20 mg/L FeSO4、10 mg/L MnSO4、2 mg/L维生素B1,3,5,12、2 mg/L维生素H、8 mg/L酚红，pH 7.0–7.2；接种量：10%（v/v）；摇瓶培养条件：37°C、220 rpm、24 h；补料：60%（w/v）葡萄糖；乙胺盐酸盐补加：5 mL（16%，m/v），每3 h一次；平行实验：三次
2.4 5 L生物反应器补料分批发酵
将活化菌株从试管划线至琼脂斜面，37 °C培养12 h，随后将适量细胞接种至含2 L种子培养基的5 L生物反应器中。pH自动维持在7.0，溶解氧（DO）水平在37 °C下控制在约30%（v/v）。待OD600达到约20时，将600 mL种子培养液与1.9 L发酵培养基一同转入5 L发酵罐。当发酵液中葡萄糖耗尽时，以受控速率补加800 g/L葡萄糖溶液，确保整个过程中葡萄糖浓度始终低于1 g/L。
【数据】生物反应器体积：5 L；种子培养基体积：2 L；pH：7.0（自动维持）；溶解氧：约30%（v/v）；温度：37°C；转接条件：OD600约20；转接体积：600 mL种子培养液+1.9 L发酵培养基；补料葡萄糖浓度：800 g/L；葡萄糖残留控制：<1 g/L
2.5 分子对接模拟
本研究使用Discovery Studio 2019软件进行分子对接模拟。MeGMAS和MuGMAS的结构以MuGMAS晶体结构（PDB ID: 5QUR）为模板，使用AlphaFold2预测。两种配体L-谷氨酸（PubChem CID: 33032）和乙胺（PubChem CID: 6341）从PubChem数据库以3D格式获取。结合位点根据先前报道的活性中心位置定义[32,33]。结构优化后的L-谷氨酸或乙胺在CHARMm力场下使用高精度分子对接方法对接到制备的GMAS蛋白上[34,35]。选择最优对接构象并使用PyMOL软件进行可视化。
【数据】软件：Discovery Studio 2019；结构预测：AlphaFold2；模板：MuGMAS晶体结构（PDB ID: 5QUR）；配体：L-谷氨酸（PubChem CID: 33032）、乙胺（PubChem CID: 6341）；力场：CHARMm；可视化：PyMOL
2.6 适应性实验室进化
将乙醛（99%，无水级；CAS号75–07–0；上海阿拉丁生化科技股份有限公司）添加至M9基本培养基中以评估其对大肠杆菌的抑制作用。培养物在37 °C、220 rpm下培养24 h，通过测定OD600监测细胞生长。适应性实验室进化在含5 mL M9培养基的试管中通过连续传代进行，设两个平行。初始乙醛添加量为40 μL，每24 h转接一次。当培养物OD600达到0.6–0.7时，以5 μL递增增加剂量。由于乙醛的高挥发性和低沸点，将确定体积的纯无水乙醛（ρ = 0.783 g/mL）直接补充至培养基中。最终浓度根据其密度和分子量（44.05 g/mol）计算，在5 mL培养基中添加30、40、50和60 μL分别对应106 mM、142 mM、178 mM和213 mM。进化过程完成后，将进化后的谱系在含106–213 mM乙醛的试管中重新挑战以评估耐受性变化。随后，在固体培养基上分离对213 mM乙醛具有耐受性的细胞。挑取单菌落接种至含213 mM乙醛的M9培养基的96孔板中，37 °C、220 rpm培养24 h以评估生长表型。使用SpectraMax iD3酶标仪（Molecular Devices，美国）定量生物量。选择生物量最高的菌株用于后续补料分批发酵。
【数据】乙醛：99%无水级，CAS 75–07–0，密度0.783 g/mL，分子量44.05 g/mol；初始添加量：40 μL；转接间隔：24 h；剂量递增：5 μL；OD600阈值：0.6–0.7；对应浓度：30 μL→106 mM、40 μL→142 mM、50 μL→178 mM、60 μL→213 mM；培养基：M9基本培养基（5 mL）；培养条件：37°C、220 rpm、24 h；酶标仪：SpectraMax iD3（Molecular Devices，美国）；平行：两个
2.7 统计分析
除另有说明外，所有实验均设三个独立生物学重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计显著性采用单因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett多重比较检验进行评估。p ≤ 0.05认为差异具有统计学意义。
【数据】重复数：三个独立生物学重复；数据表示：平均值±标准差；统计方法：单因素方差分析（ANOVA）+ Dunnett多重比较检验；显著性阈值：p ≤ 0.05
研究结果
3.1 优化茶氨酸合成酶表达实现乙胺依赖型L-茶氨酸生物合成
细菌GMAS（由gmas编码）在L-茶氨酸生产中发挥重要作用。它催化γ-谷氨酰基从供体L-谷氨酸转移至受体乙胺，同时伴随ATP水解。在先前的研究中，Corynebacterium glutamicum GDK-9首次被改造为在5 L发酵罐中生产42 g/L L-茶氨酸，产率为19.6%。酶活性实验表明，来自M. mays、M. extorquens和M. universalis的GMAS酶对L-谷氨酸和乙胺表现出良好的活性[12]。由此可见，从甲胺同化细菌中分离的GMAS可能普遍可用于L-茶氨酸生物合成[1,26]。因此，我们首先筛选了这三个GMAS候选酶，包括MmGMAS（由Mmgmas编码）、MeGMAS（由Megmas编码）和MuGMAS（由Mugmas编码），以在大肠杆菌中构建L-茶氨酸生物合成途径（图2A）。
摇瓶发酵实验表明，过表达Mmgmas基因的菌株表现最佳，产L-茶氨酸15.8 g/L，分别比Megmas和Mugmas的产量高25%和87.5%（图2C）。为达到与质粒表达Mmgmas相当的生产水平，我们将多拷贝整合到亲本菌株THE-0中（图2B）。所得菌株THE-3携带三个拷贝的Mmgmas，由Ptrc启动子控制，产L-茶氨酸14.8 g/L（图2C）。
先前研究已证明MmGMAS对L-谷氨酸和乙胺的比活性约为MeGMAS和MuGMAS的两倍[12,25]。然而，这种增强催化效率的结构基础仍不清楚，特别是决定其潜在乙胺底物偏好的分子因素。阐明GMAS与其底物的催化机制将为理性工程策略提供坚实基础，以实现高效L-茶氨酸生物合成。
【数据】质粒表达Mmgmas产量：15.8 g/L L-茶氨酸；Megmas产量：比Mmgmas低25%（即约12.6 g/L）；Mugmas产量：比Mmgmas低87.5%（即约8.4 g/L）；THE-3（三拷贝Mmgmas整合）：14.8 g/L L-茶氨酸；MmGMAS比活性：约为MeGMAS和MuGMAS的2倍；出发菌株：THE-0；启动子：Ptrc
3.2 阐明GMAS结合机制以表征其乙胺偏好性
通过DNAMAN软件分析，MmGMAS、MeGMAS和MuGMAS的序列比对结果见图3A。MmGMAS与MuGMAS相似性最高（68.5%一致性），而MeGMAS与MmGMAS和MuGMAS的一致性约为30–40%。这表明MeGMAS可能具有与其他两种酶不同的底物结合模式。据此，我们通过分子对接分析研究了三种GMAS变体之间结合机制的差异。MmGMAS与ATP复合物的晶体结构以2.65 Å分辨率解析（PDB: 5QUR）[33]。在此基础上，使用AlphaFold2预测了MeGMAS和MuGMAS的三维结构。如图3所示，对三种蛋白质受体与配体L-谷氨酸和乙胺进行了半柔性对接。
尽管L-谷氨酸似乎被紧密包裹在相同的结合位点中，但关键残基与配体之间的相互作用存在显著差异。在MmGMAS与L-谷氨酸的对接模型中，Arg-297带正电荷的胍基与L-谷氨酸的羧基形成强静电和氢键相互作用；His-242的咪唑环与L-谷氨酸的氨基形成氢键；Trp-309的吲哚环通过π-π堆积或疏水相互作用稳定底物；Glu-128的羧基与L-谷氨酸的氨基形成氢键（图3B）。这些相互作用形成密集的氢键网络，将L-谷氨酸牢固地固定在高稳定性的活性口袋中。
相比之下，对于MeGMAS，不仅关键残基的位置与MmGMAS和MuGMAS显著不同，相互作用模式也发生了实质性变化。它不再与保守基序-GATWAP-中的Trp残基相互作用，而是依赖间隔基序-GXGXHXHXS-（其中X表示任意氨基酸残基）中His-236附近的Gly-232形成氢键（图3C）。这种改变的相互作用模式也影响其他氨基酸残基与配体的结合，导致L-谷氨酸结合稳定性降低。对于MuGMAS，虽然存在与Lys-230的额外相互作用，但残基间相互作用的整体强度普遍弱于MmGMAS（图3D），这可能是其酶活性较低的原因之一。
对于乙胺，带正电荷的–NH3+基团可与MmGMAS和MuGMAS结合口袋中的三个残基形成氢键和静电相互作用，包括Glu-128、Glu（185或186）和Gln（190或191）（图3B和D）。Glu-128残基同时参与两种配体的结合，实现双底物协同结合。Glu和Gln残基位于同一保守区域-DHEDANGQFE-内。该区域观察到的结合模式与先前报道的MmGMAS甲胺结合位点一致[33]。在MuGMAS中，乙胺与Glu-185的羰基氧原子形成氢键，而在MmGMAS中，乙胺与羧基中的羟基氧原子相互作用。这种细微差异可能是活性口袋三维形状不同的原因之一。与此一致，表面表示显示MmGMAS的活性口袋形成更封闭的几何结构，将乙胺限制在更小的体积内，这可能是复合物稳定性增强的原因。相比之下，MeGMAS和MuGMAS的活性口袋使乙胺更多地暴露在表面，降低了结合稳定性。总体而言，这些发现揭示了这些GMAS直系同源物催化效率各异的原因，并为其通过蛋白质工程进行优化奠定了基础。
【数据】MmGMAS与MuGMAS序列一致性：68.5%；MeGMAS与MmGMAS/MuGMAS一致性：约30–40%；MmGMAS晶体结构分辨率：2.65 Å（PDB: 5QUR）；MmGMAS关键残基：Arg-297、His-242、Trp-309、Glu-128；保守基序：-GATWAP-、-GXGXHXHXS-、-DHEDANGQFE-；MeGMAS关键残基：Gly-232、His-236；MuGMAS额外相互作用：Lys-230；乙胺结合残基：Glu-128、Glu(185/186)、Gln(190/191)
3.3 阻断L-茶氨酸降解途径以提高产量
GGT（由ggt编码）是一种双功能酶，催化三种反应：γ-谷氨酰转肽、水解和自转肽[36,37]。具体而言，大肠杆菌内源性GGT，也称为谷胱甘肽水解酶，可将谷胱甘肽水解为L-半胱氨酰甘氨酸和L-谷氨酸[38]。这表明其可能参与L-茶氨酸的降解（图4A）。研究人员进一步证明，敲除ggt基因可促进L-茶氨酸在大肠杆菌中的积累[26]。通过同源序列比对发现，ggt也存在于C. glutamicum中。同样，ggt的缺失使C. glutamicum中L-茶氨酸产量提高了13.71%[24]。因此，我们构建了THE-3的ggt缺陷突变体（图4B），然后通过在不供应乙胺的M9基本培养基中添加外源L-茶氨酸来评估其分解L-茶氨酸的能力。
如图4C所示，与THE-3相比，在添加2 g/L和5 g/L L-茶氨酸的条件下，THE-4的胞内L-茶氨酸浓度分别增加了9.1%和116.3%，总L-茶氨酸浓度分别增加了20%和11.1%。这进一步证实了GGT在L-茶氨酸水解反应中的活性。显然，部分外源L-茶氨酸进入细胞，表明大肠杆菌中可能存在L-茶氨酸转运蛋白。在此背景下，由于L-茶氨酸与L-谷氨酰胺的结构相似性，酵母谷氨酰胺透性酶GNP1也已被明确证明具有L-茶氨酸转运活性[39]。据此，在大肠杆菌中发现了L-谷氨酰胺透性酶GlnP（由glnP编码）并在THE-3中进行了敲除（图4A和B）。胞外L-茶氨酸含量增加。
【数据】ggt敲除菌株：THE-4；添加2 g/L L-茶氨酸时胞内浓度增加：9.1%；添加5 g/L L-茶氨酸时胞内浓度增加：116.3%；添加2 g/L时总L-茶氨酸增加：20%；添加5 g/L时总L-茶氨酸增加：11.1%；C. glutamicum中ggt缺失产量提升：13.71%；L-茶氨酸添加量：2 g/L和5 g/L；培养基：M9基本培养基（无乙胺供应）
3.4 强化THE-6中丙酮酸和L-谷氨酸供给
L-茶氨酸生物合成需要L-谷氨酸和乙胺作为前体。为增强前体供给，我们首先强化了丙酮酸和L-谷氨酸的代谢通量（图5A）。丙酮酸是L-谷氨酸生物合成的关键前体。我们过表达了来自B. adolescentis的Baxfp（果糖-1,6-二磷酸酶）以增强磷酸烯醇式丙酮酸到果糖-6-磷酸的碳回流，并敲除了MspckA（来自M. succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）以减少草酰乙酸的消耗。同时，我们过表达了谷氨酸脱氢酶以增强α-酮戊二酸向L-谷氨酸的转化。在THE-4基础上进行这些遗传操作后获得菌株THE-6（图5B）。
通过乙胺供应的摇瓶发酵结果显示，THE-6产L-茶氨酸16.8 g/L，较THE-4有所提高（图5C）。发酵实验进行三次平行，图中显示重复间的标准差。
【数据】菌株：THE-6（在THE-4基础上过表达Baxfp、敲除MspckA、过表达谷氨酸脱氢酶）；L-茶氨酸产量：16.8 g/L；平行实验：三次；图中显示标准差
3.5 在THE-9中开发乙胺合成的脱羧途径
为实现无需外源乙胺添加的L-茶氨酸生产，我们在THE-6中开发了基于脱羧途径的乙胺胞内合成（图6A）。该途径通过CsAlaDC（来自C. sinensis的L-丙氨酸脱羧酶）催化L-丙氨酸脱羧生成乙胺。首先在THE-9中通过质粒过表达CsAlaDC和BsAlaDH（来自B. subtilis 168的丙氨酸脱氢酶）（图6B），随后进行基因组整合（图6C）。
摇瓶发酵结果显示，THE-9产L-茶氨酸22.8 g/L（在乙胺供应条件下），而在无外源乙胺条件下，THE-13产L-茶氨酸19.5 g/L和L-丙氨酸5.4 g/L（图6D）。
【数据】菌株：THE-9（乙胺供应，22.8 g/L L-茶氨酸）、THE-13（无外源乙胺，19.5 g/L L-茶氨酸+5.4 g/L L-丙氨酸）；关键酶：CsAlaDC（C. sinensis L-丙氨酸脱羧酶）、BsAlaDH（B. subtilis 168丙氨酸脱氢酶）；途径：脱羧途径
3.6 在THE-13中开发乙胺合成的转氨途径
为进一步提高乙胺供应并减少L-丙氨酸积累，我们在THE-13中开发了转氨途径（图7A）。该途径通过eutE（来自大肠杆菌的乙醛脱氢酶）、Zmpdc（来自Z. mobilis的丙酮酸脱羧酶）和PpspuC（来自P. putida的腐胺转氨酶）协同作用，以L-丙氨酸为氨基供体合成乙胺。首先通过质粒过表达这三个基因（图7B），随后进行基因组整合（图7C）。
摇瓶发酵结果显示，工程菌株在无外源乙胺条件下产L-茶氨酸进一步提升（图7D）。
【数据】菌株：THE-13衍生菌株（转氨途径）；关键酶：eutE（大肠杆菌乙醛脱氢酶）、Zmpdc（Z. mobilis丙酮酸脱羧酶）、PpspuC（P. putida腐胺转氨酶）；氨基供体：L-丙氨酸；原文未详述该段具体产量数值
3.7 THE-9、THE-13和进化菌株THE-17的补料分批发酵
对THE-9、THE-13和进化后的THE-17在5 L生物反应器中进行补料分批发酵评估（图8）。THE-17经乙醛耐受性适应性进化获得。最终工程菌株THE-17在补料分批发酵中实现了118.2 g/L的L-茶氨酸产量，产率为0.389 g/g葡萄糖，生产强度为2.46 g/L/h。
【数据】菌株：THE-17（经乙醛耐受性进化）；L-茶氨酸产量：118.2 g/L；产率：0.389 g/g葡萄糖；生产强度：2.46 g/L/h；发酵规模：5 L生物反应器；对比菌株：THE-9、THE-13
讨论与解读
本研究建立了绿色、可持续且高效的L-茶氨酸生产策略，通过在大肠杆菌中工程化双路径乙胺生物合成实现。研究通过三个关键战略步骤：(1) 优化L-茶氨酸合成酶MmGMAS的表达并阐明其对乙胺的底物偏好机制，同时删除L-茶氨酸降解途径并增强前体供给；(2) 开发脱羧途径并优化CsAlaDC表达，实现无需外源乙胺添加的L-茶氨酸合成；(3) 构建协同转氨途径以最小化L-丙氨酸积累并提高碳利用效率。经乙醛耐受性适应性实验室进化后，最终工程菌株THE-17在补料分批发酵中达到118.2 g/L的产量，产率0.389 g/g葡萄糖，生产强度2.46 g/L/h，为目前报道的最高L-茶氨酸产量。与依赖外源乙胺添加的传统"半发酵-半生物转化"工艺不同，本方法利用胞内合成的乙胺进行L-茶氨酸生产。
编译者解读：该研究在合成生物学层面展示了"替代危险底物"的经典范式——通过胞内代谢途径重构，将外源添加乙胺转变为自主供应，同时以适应性进化解决中间代谢物乙醛的毒性瓶颈。118.2 g/L的产量和2.46 g/L/h的生产强度已接近工业发酵经济性阈值。不过，双路径乙胺合成的碳代谢负担与副产物L-丙氨酸的积累仍是进一步优化的空间，未来可结合动态调控或途径解耦策略进一步提升碳原子经济性。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181930
DOI: 10.1016/j.cej.2026.181930