来源：外泌体提取纯度低密度梯度（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
跑了整夜超速离心，NTA 一测粒径双峰、WB 里 CD9 有带、Calnexin 也亮着，纯度就是上不去。这种"看着有、实测杂"的情况，八成不是梯度原理错了，而是某个操作细节漏了。下面按"样本—浓缩—铺梯度—离心—收组分—鉴定"六步，把每一步的现象、判断动作和具体参数都给你列清楚，下一管直接照着改。
第一步：先别怀疑梯度，查这几个低级错误
- 起始上清没除干净细胞碎片。收来培养基直接上梯度，300g 那步省了。补做：4°C 下 300×g 10 min → 2000×g 20 min → 10000×g 30 min，每次只吸上清，最后一次留 1 mL 别碰管底沉淀。
- 梯度介质拿混了。OptiPrep 母液是 60% (w/v) 碘克沙醇，不是 60% 蔗糖，稀释要按质量体积比算。折光仪测一下，20°C 下 6% 约 1.3455、18% 约 1.3890，偏了就是配错。
- 收组分靠管号盲收，没测密度。1.06 和 1.20 g/mL 的管全并在一起，脂蛋白当然跟着走。
- 转子选错。等密度分离必须用水平转子（SW41 Ti 这类），角转子会把梯度甩成斜层，跑完界面全糊。
第二步：分维度系统排查
1. 样本预处理不彻底，碎片和大蛋白被带下来
现象：TEM 里满屏膜碎片和 20 nm 以下小囊泡；NTA 主峰在 100 nm 但拖着长尾。原理是 10000×g 只能沉掉大部分凋亡小体，40–100 nm 的微粒还在悬液里，密度同样落在 1.10–1.16 g/mL，梯度根本分不开。步骤：上清依次走 300×g 10 min、2000×g 20 min、10000×g 30 min，全程 4°C；无血清培养记得收样前换液 24 h，血清要用 100,000×g 16 h 预处理过的。验证：预处理后取上清跑 NTA，颗粒数应比原始上清降一个数量级左右。
2. 浓缩环节引入聚合物和蛋白聚集体
现象：梯度里冒出白色絮状带，NTA 粒径分布很宽，WB 里 ApoB、Albumin 明显。原理是 100 kDa 超滤膜会富集可溶性蛋白、甚至截留成胶束；PEG 残留也会在 1.10–1.15 g/mL 处成带，跟外泌体重叠。步骤：优先用 100 kDa MWCO 超滤，把 30 mL 上清浓缩到 0.5 mL，离心力不超过 4000×g、4°C，别起泡；用过 PEG 的，必须 PBS 稀释 10 倍后再超滤换液 3 次以上。验证：浓缩前后各跑一次 NTA，峰位从 120 nm 漂到 60 nm 就是聚集体。
3. 梯度铺层和介质选错
现象：密度测出来一条糊带，没有清晰界面；CD63 出现在四五个组分里。原理是碘克沙醇黏度高、扩散慢，但拿小枪头沿壁快加照样混层；蔗糖梯度渗透压高（2.5 M 约 2500 mOsm），会让外泌体皱缩、密度上飘。步骤：用长针头贴壁，从高密度往低密度铺，每层 1.2 mL，6%/8%/10%/12%/16%/18% 共 6 层，铺完 4°C 静置 30 min 让界面平整；有梯度仪就直接线性铺 6–18%。验证：铺完从管口往下每 0.2 mL 测折光，折光—密度曲线应是单调直线，R² 大于 0.