来源：Metabolic and transport engineering enable efficient de novo biosynthesis of patchoulol in Saccharomyces cerevisiae（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
广藿香醇是一种广泛应用于香精香料和化妆品领域的高价值倍半萜，但植物提取效率低、资源消耗大。本研究将酶工程、途径工程与转运工程相结合，在酿酒酵母中构建了广藿香醇高产底盘。通过对广藿香醇合酶（PTS）的半理性设计提升催化效率，结合多拷贝表达，摇瓶效价从0.40 ± 0.05 mg/L提升至258.72 ± 27.35 mg/L；强化糖酵解和甲羟戊酸途径并下调ERG9后，进一步将代谢通量导向FPP。基于分子对接与转录分析，研究者鉴定出PDR12为有效外排泵，诱导型过表达使效价达到372.80 ± 14.92 mg/L。在5 L生物反应器两阶段补料分批发酵中，最优菌株产量达2.86 g/L（2856.25 mg/L）。
研究背景
广藿香醇是广藿香油中的核心倍半萜成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物活性，是广藿香油药理作用和香气特征的主要物质基础。传统上广藿香醇依赖植物提取，但常规提取方法效率低、资源依赖性强；化学合成路线则往往步骤冗长且对环境不友好。因此，亟需一种绿色高效的植物天然产物生产方法。合成生物学通过设计微生物细胞工厂，利用微生物固有代谢途径合成异源植物天然产物，可减少对自然资源的依赖，推动绿色生产策略的发展。近年来，工程化微生物异源发酵合成已成功用于多种植物天然产物的生产。本研究即在此背景下，通过代谢工程与转运工程相结合的策略，系统提升酿酒酵母中广藿香醇的产量。
研究方法
2.1 菌株、培养基与试剂
大肠杆菌TOP10用于载体构建和质粒扩增，培养和筛选在Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中进行，并添加100 mg/L羧苄青霉素。酿酒酵母CEN.PK2–1C用作亲本菌株。本研究所使用和构建的酵母菌株见表S1。酵母菌株在酵母膏胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中培养。酵母转化子在不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基（1.7 g/L无氨基酸酵母氮源、5 g/L硫酸铵、20 g/L葡萄糖、1.3 g/L酵母合成缺陷培养基补充物）上筛选。广藿香醇标准品和十二烷分别购自Solarbio（北京）和Aladdin（上海）。
【数据】菌株：大肠杆菌TOP10、酿酒酵母CEN.PK2–1C；培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）、合成完全培养基（1.7 g/L酵母氮源、5 g/L硫酸铵、20 g/L葡萄糖、1.3 g/L补充物）；抗生素：100 mg/L羧苄青霉素；试剂来源：Solarbio（北京）、Aladdin（上海）
2.2 质粒构建
本研究所构建的所有质粒见表S2。用于质粒构建和基因组整合的所有引物见表S3。广藿香醇合酶基因（PTS，GenBank ID: MG386648.1）经密码子优化以适应酿酒酵母表达，由生工生物（上海，中国）合成。内源基因通过PCR扩增从CEN.PK2–1C基因组中获得。
【数据】基因：PTS（GenBank ID: MG386648.1）；密码子优化：针对酿酒酵母；合成公司：生工生物（上海）；内源基因来源：CEN.PK2–1C基因组PCR扩增；质粒列表：表S2；引物列表：表S3
2.3 酵母菌株构建
将至少与整合位点具有40 bp重叠的基因表达扩增盒通过醋酸锂方案[19]转化到酿酒酵母中，然后在氨基酸缺陷培养基上平板培养2–3天。带有同源臂的基因表达盒通过PCR扩增，并通过同源重组整合到相应的基因组位点。采用Cre/loxP重组系统进行标记回收。为实现连续基因编辑，将工程菌株交叉划线到YPD + 5-FOA（5-氟乳清酸）平板上以去除pSH65质粒。
【数据】同源臂长度：至少40 bp；转化方法：醋酸锂方案；平板培养时间：2–3天；标记回收系统：Cre/loxP；质粒去除：YPD + 5-FOA平板；质粒：pSH65
2.4 摇瓶培养
从SD平板上挑取单菌落，接种到装有3 mL合成完全培养基的试管中，30 °C、220 rpm过夜培养。然后将种子培养物接种到装有50 mL YPD的250 mL摇瓶中，初始光密度（OD600）为0.1，在30 °C、220 rpm下培养120 h。对于进行两相发酵的菌株，加入10%（v/v）十二烷作为有机相。所有600 nm光密度均使用Thermo Scientific BioMate 160紫外分光光度计测量。
【数据】种子培养基：3 mL合成完全培养基；种子培养条件：30 °C、220 rpm、过夜；摇瓶体积：250 mL；装液量：50 mL YPD；初始OD600：0.1；培养温度：30 °C；转速：220 rpm；培养时间：120 h；有机相：10%（v/v）十二烷；OD测量仪器：Thermo Scientific BioMate 160
2.5 分析方法
对于广藿香醇分析，将酵母培养物（50 mL）以4500 rpm离心10 min。用注射器取出上层十二烷相，通过0.22 μm尼龙膜过滤到GC-MS样品瓶中。GC-MS（Agilent 5977B GC/MSD；30 m × 0.25 mm × 0.25 μm色谱柱）在250 °C下操作（分流比10:1；进样量1 μL），氦气流速1.0 mL/min。程序升温：120 °C保持1 min，以3 °C/min升至260 °C（保持30 s），再以10 °C/min升至270 °C（保持5 min）；接口温度220 °C。广藿香醇在约9.0 min洗脱，对照外标定量。除非另有说明，本研究报告的广藿香醇效价均指从十二烷覆盖层中定量的浓度；水相和胞内组分未定量。
【数据】离心：4500 rpm、10 min；过滤膜：0.22 μm尼龙膜；GC-MS型号：Agilent 5977B GC/MSD；色谱柱：30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；进样口温度：250 °C；分流比：10:1；进样量：1 μL；载气：氦气、1.0 mL/min；升温程序：120 °C 1 min → 3 °C/min → 260 °C（30 s）→ 10 °C/min → 270 °C（5 min）；接口温度：220 °C；广藿香醇保留时间：约9.0 min；定量方式：外标法
2.6 分子对接
使用AutoDock Tools 1.5.6进行分子对接，预测广藿香醇与转运蛋白（PDR5、PDR12、STE6、YOR1）之间的结合构象和结合自由能。转运蛋白的预测结构从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）或AlphaFold数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）获得。广藿香醇的分子结构从ZINC数据库检索。蛋白质结构通过去除水分子、添加氢原子和计算Gasteiger电荷进行预处理。配体通过添加极性氢原子制备。对接网格设置为覆盖转运蛋白的跨膜胞内区域，对接盒参数总结于表1。PTS的预测结构（Uniprot编号：Q49SP3）来源于Uniprot蛋白结构数据库（https://www.uniprot.org/）。FPP的分子结构从Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得。分子对接结果使用PyMOL 3.0.3软件可视化，并列于图S3。
【数据】对接软件：AutoDock Tools 1.5.6；靶蛋白：PDR5、PDR12、STE6、YOR1；结构来源：PDB、AlphaFold、Uniprot（Q49SP3）；配体来源：ZINC（广藿香醇）、Pubchem（FPP）；可视化软件：PyMOL 3.0.3；对接盒参数：表1；对接结果：图S3
2.7 实时定量PCR（qRT-PCR）分析
按照制造商说明，使用Spin Column Yeast Total RNA Purification Kit（生工生物，上海，中国）提取总RNA。使用Accurate Biology的Evo M-MLV反转录预混示踪试剂盒（gDNA wiper）和SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒进行反转录和RT-qPCR。设计用于基因表达分析的特异性引物并用于qRT-PCR（表S3）。以ACT1作为内参基因，使用Roche荧光定量PCR仪进行荧光检测。实验结果采用2-ΔΔCt方法[20]分析。
【数据】RNA提取试剂盒：Spin Column Yeast Total RNA Purification Kit（生工生物）；反转录试剂盒：Evo M-MLV（Accurate Biology）；qPCR试剂盒：SYBR Green Pro Taq HS（Accurate Biology）；内参基因：ACT1；仪器：Roche荧光定量PCR仪；分析方法：2-ΔΔCt法；引物：表S3
2.8 补料分批发酵
广藿香醇生产的补料分批发酵在5 L生物反应器中进行，装有2 L发酵培养基（40 g/L葡萄糖、6 g/L酵母提取物、12 g/L硫酸铵、1.5 g/L MgSO4·7H2O、6 g/L KH2PO4、3 g/L Na2HPO4·12H2O、3 mg/L CaCl2·2H2O、1 mL/L微量元素储备液（1000 × ）和1 mL/L维生素储备液（1000 × ））。将单克隆培养物接种到4 mL SD培养基中过夜培养。随后，将1 mL种子培养物转移到四个250 mL摇瓶中，每个摇瓶含50 mL SD培养基，在30 °C、220 rpm下培养至光密度达到2–3。之后，以10%的接种量将二级种子培养物接种到含2 L发酵培养基的5 L发酵罐中。pH维持在5.5，发酵温度设定为30 °C，搅拌转速200–600 rpm，确保溶解氧水平保持在30%以上。发酵24 h后，补充营养物质，并再加入10%十二烷。开始补料后，每12 h补充酵母提取物粉末作为氮源，至终浓度6 g/L。葡萄糖耗尽后，加入20 g/L半乳糖以刺激广藿香醇的积累。在后续发酵阶段，乙醇替代葡萄糖作为碳源，乙醇浓度维持在10 g/L以下。
【数据】反应器体积：5 L；发酵培养基体积：2 L；培养基组成：40 g/L葡萄糖、6 g/L酵母提取物、12 g/L硫酸铵、1.5 g/L MgSO4·7H2O、6 g/L KH2PO4、3 g/L Na2HPO4·12H2O、3 mg/L CaCl2·2H2O、1 mL/L微量元素、1 mL/L维生素；种子培养：4 mL SD、过夜；二级种子：1 mL转接至4×250 mL摇瓶（50 mL SD）、30 °C、220 rpm、OD 2–3；接种量：10%；pH：5.5；温度：30 °C；搅拌：200–600 rpm；溶解氧：>30%；补料起始：24 h；十二烷添加：10%；氮源补加：每12 h、终浓度6 g/L；诱导剂：20 g/L半乳糖；碳源切换：乙醇、<10 g/L
2.9 统计分析
结果以三次生物学重复的平均值 ± 标准差表示。所有统计评估（p值）使用双尾t检验进行（∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001）。
【数据】重复数：3次生物学重复；数据表示：平均值 ± 标准差；统计方法：双尾t检验；显著性水平：∗P < 0.05、∗∗P < 0.01、∗∗∗P < 0.001
研究结果
3.1 广藿香醇合酶的蛋白质工程改造以提高其催化活性
酿酒酵母含有内源性MVA途径，为广藿香醇合成提供了重要潜力。为建立广藿香醇从头生物合成途径，将来自广藿香（Pogostemon cablin (Blanco) Benth.）的PTS基因按照酿酒酵母偏好进行密码子优化，然后整合到CEN.PK2–1C菌株的染色体中。工程菌株P01在摇瓶中产生0.40 ± 0.05 mg/L广藿香醇（图S1）。通过表达异源关键酶，广藿香醇生物合成途径在酿酒酵母中成功构建。
天然广藿香醇合酶催化效率和特异性较低，PTS酶在催化FPP转化为广藿香醇的同时，还会产生至少13种额外的倍半萜副产物[21]。PTS的低催化效率和特异性是广藿香醇生物合成的主要限制因素。定点突变是一种分子生物学技术，通过精确修饰基因编码序列中的特定核苷酸，在酶蛋白的特定氨基酸位点引入预定突变。通过改变催化活性中心的关键残基，可以优化酶与底物之间的结合亲和力，提高酶的催化效率[22,23]。天然变体PTS1（GenBank: MG386648.1）的酶学改造尚未在酿酒酵母中报道。PTS var.1[24]的催化效率显著高于其他天然变体。PTS var.1与PTS1仅有两个氨基酸残基的差异：S103 N和G457E突变。
采用半理性设计策略增强PTS合成广藿香醇的催化性能。通过分子对接预测PTS（受体）与FPP（配体）之间的相互作用。突变热点残基的选择基于其是否位于口袋或活性位点中。根据文献报道的酶工程策略[25]和对接模型（图2A），选择PTS催化结构域中的七个关键残基（S103、W276、T404、Y407、G457、Y525、Y531）作为理性设计靶点。
在FPP周围的残基中，氨基酸残基N448、D304和D306参与三个镁离子的配位，这些镁离子是催化所必需的。这些残基的替换可能导致酶活性完全丧失。氨基酸W276、Y407、Y525和Y531具有大而刚性的芳香环，可能阻碍FPP与PTS在其活性位点的结合。因此，将这些残基替换为侧链较小的氨基酸。将突变体Y407A、W525A和W531A转化到PT01菌株中，导致广藿香醇效价显著降低。这表明这些残基与FPP之间形成的相互作用对PTS的催化效率有显著影响。对W276、T404和G457进行的突变产生了比野生型PTS更高的催化活性。G457E突变体将广藿香醇产量最高提高了244%，浓度为1.39 mg/L（相比野生型）。G457E位于Mg2+结合位点附近，通过其带负电荷的侧链促进Mg2+配位的增强。因此，这通过电荷平衡机制促进了广藿香醇合酶催化效率的提高。
结构引导的芳樟醇合酶t67OMcLIS工程化改造通过修饰底物结合口袋附近的残基实现，以F447E突变为代表[26]。这种改变降低了空间位阻和疏水性，从而改善了酶性能并提高了芳樟醇产量。活性口袋的空间尺寸决定反应中间体（特别是C态碳正离子）的构象灵活性。通过工程化F441突变来调节酶活性位点的结构架构，可以精确改变这些中间体的构象动力学，从而实现对檀香烯比例的精细调控[27]。在(+)-瓦伦烯合酶（EgVS）中，底物结合口袋内关键残基的替换，如CnVS中的I533V，可能增加结合腔体积并导致瓦伦烯产量提高[28]。
与携带野生型广藿香醇合酶（PTS）的菌株相比，PTST404S突变株中的主要代谢物被鉴定为α-布藜烯。该菌株中α-布藜烯的色谱峰面积是特征性广藿香醇峰面积的3.1–3.3倍，显著超过PTSG457E突变体中观察到的1.0–1.3倍比率。这一观察表明T404S突变特异性增强了向α-布藜烯生物合成的代谢通量。随后，以突变体G457E为模板进行第二轮饱和突变。出乎意料的是，突变体G457E/W276A与单突变体相比略微提高了广藿香醇效价，但突变体G457E/T404A表现出显著降低的催化活性。
我们使用PTS的理性设计实现了产物的定向重分布和催化效率的协同增强。G457E/W276A替换位于PTS的催化结构域内，而非宿主特异性调控元件。因此，这些突变预计具有可移植性，当引入其他高流通量酵母底盘时也可能增强广藿香醇产量。然而，最终改善可能取决于前体可用性（FPP供应）、竞争性甾醇生物合成以及分泌/耐受能力；因此，应在不同生产背景中评估这些效应。
【数据】基础菌株：CEN.PK2–1C；初始效价：0.40 ± 0.05 mg/L（PT01）；突变位点：S103、W276、T404、Y407、G457、Y525、Y531；副产物：至少13种倍半萜；G457E效价提升：244%、1.39 mg/L；α-布藜烯峰面积比：3.1–3.3倍（T404S）vs 1.0–1.3倍（G457E）；Mg2+配位残基：N448、D304、D306
3.2 优化广藿香醇生物合成的代谢网络
乙酰辅酶A是MVA途径的起始原料，连接酵母的中心碳代谢。为增强乙酰辅酶A可用性，先前研究表明在酿酒酵母中过表达人缺氧诱导因子HIF-1可促进糖酵解相关酶的表达，导致胞质丙酮酸增加，进而促进乙酰辅酶A积累[29]。因此，将HIF-1表达盒整合到菌株PT01的基因组中，获得菌株PT02，其过表达PTSG457E/W276A。HIF-1的过表达导致广藿香醇产量显著增加，达到2.52 ± 0.23 mg/L。丙酮酸是糖酵解途径后碳代谢的主要分支点。丙酮酸脱氢酶旁路通过丙酮酸脱羧酶、胞质醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合成酶（ACS）的作用将丙酮酸转化为乙酰辅酶A[30]。为增强进入甲羟戊酸途径的碳通量，在PT02基础上引入了来自沙门氏菌的乙酰辅酶A合成酶突变体SeACSL641P。出乎意料的是，PT03菌株中广藿香醇效价从2.52 ± 0.23降至0.98 ± 0.12 mg/L。在酿酒酵母中，甲羟戊酸（MVA）途径是萜类化合物生物合成的基础代谢路线。该途径以乙酰辅酶A为底物，经过多个酶催化反应生成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），它们是萜类骨架组装的关键前体[31]。MVA途径的代谢通量受关键限速酶（如HMG-CoA还原酶）直接调控，其动态平衡显著影响下游倍半萜的合成效率和最终产量。
【数据】HIF-1过表达效价：2.52 ± 0.23 mg/L（PT02）；SeACSL641P引入后效价：0.98 ± 0.12 mg/L（PT03）；关键酶：丙酮酸脱羧酶、ALD6、ACS；前体：IPP、DMAPP；限速酶：HMG-CoA还原酶
3.3 “推-拉-限制”策略提高广藿香醇效价
3.4 ABC转运蛋白对广藿香醇生产的影响
3.5 工程菌株PT13在5 L生物反应器中的高密度发酵
讨论与解读
本研究通过模块化代谢工程、蛋白质工程和转运工程的结合，实现了广藿香醇的高水平生产，效价达到2.86 g/L（2856.25 mg/L）。如表2所示，该效价与其他工程化微生物宿主中报道的最高水平相当，据我们所知，这是酿酒酵母中达到的最高广藿香醇效价之一。本研究首次系统探索了广藿香醇的跨膜转运机制，采用“计算预测-实验验证”闭环策略，旨在解决萜类合成中产物转运效率低的核心挑战。展望未来，进一步的改进可通过以下途径实现：（i）动态平衡甾醇/萜类通量（如ERG9和下游甾醇生物合成的分阶段调控）；（ii）扩展和精细调控外排转运蛋白及膜工程以改善分泌和耐受性；（iii）改善乙酰辅酶A/NADPH供应，同时优化生物反应器中的两相萃取工艺。这些策略为其他萜类化合物的胞外转运提供了参考。
编译者解读：该研究的方法论价值在于将转运工程纳入萜类合成的限速环节，而非仅聚焦于途径通量。PDR12的鉴定依托计算预测与转录数据的交叉验证，为疏水性产物外排提供了可复制的筛选逻辑。但需注意，研究仅对十二烷覆盖层中的广藿香醇定量，胞内与水相分布未纳入分析，这限制了对转运效率的精确评估。此外，G457E/W276A突变的可移植性尚需在其他底盘验证。总体而言，该工作为倍半萜类化合物的代谢-转运协同工程提供了可借鉴的范式。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.01.026
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.01.026