来源：Enhancing soybean straw composting through inoculation of a curated Bacillus-based synthetic microbial consortium（Environmental Technology & Innovation）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
大豆秸秆年产量超2200万吨，但木质纤维素占比约60%，利用率不足3%。传统堆肥周期长达45至60天，高温期短、降解效率低。本研究从堆肥样品中筛选构建了一组以芽孢杆菌为核心的合成菌群YB1，包含Bacillus sonorensis DF-1、Bacillus licheniformis DF-8和Bacillus subtilis DF-22。接种YB1后，堆体峰值温度提高4°C，高温期延长5天，纤维素和半纤维素降解率分别提升13.77%和21.53%，硝酸盐和总氮分别增加28%和19%。芽孢杆菌在整个堆肥周期中稳定占据优势生态位，并与多种嗜热木质纤维素降解菌形成协同功能群。
研究背景
大豆种植面积持续扩大，2023年中国大豆秸秆产量约2209万吨。其中约60%为顽固性木质纤维素，利用率不足3%。堆肥是农业废弃物资源化的可持续途径，但传统堆肥需45至60天以上才能腐熟。添加外源功能微生物加速有机质降解已成为研究热点。芽孢杆菌、木霉和白腐真菌等能分泌纤维素酶和木质素酶，对加快有机质降解、提升堆肥腐熟度至关重要。堆肥过程中微生物群落动态变化显著，高温期（≥45°C）既是木质纤维素降解的关键窗口，也是多数微生物失活的瓶颈期。因此，构建耐高温、高效降解的合成微生物菌群，成为提升堆肥效率的重要策略。
研究方法
2.1 微生物筛选与合成
使用堆肥样品进行三轮筛选以获得目标菌株：（1）在45 ± 0.5°C下快速生长（>2 mm/24 h）；（2）在以羧甲基纤维素、淀粉、酪蛋白或油脂为唯一碳源的培养平板上生长；（3）降解Whatman No. 1滤纸条。选取降解率排名前五的菌株进行后续协同降解实验（Text S1-S2）。将五株筛选菌株按1:1比例进行所有组合，开展为期7天的大豆秸秆降解实验，培养基配方参照Roberts等（2020）并加以调整。秸秆培养基具体制备方法为：将5 g秸秆粉末加入100 mL无机盐溶液中，随后接种2%体积的菌液。培养基在37°C、180 rpm振荡条件下培养7天，之后测定秸秆降解率（Text S3）。选取降解率最高的组合，命名为YB1。
【数据】筛选温度：45 ± 0.5°C；生长标准：>2 mm/24 h；秸秆粉末用量：5 g；无机盐溶液体积：100 mL；接种量：2%（v/v）；培养温度：37°C；转速：180 rpm；培养时间：7天；菌株配比：1:1
2.2 降解能力测定
采用Wu等（2022）的方法，对单株菌和协同菌群的木质纤维素生物降解关键酶活性进行测定，包括羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸酶（FPase）。酶活性以U/mL表示。简要步骤如下：将含有Whatman No. 1滤纸条或1%（w/v）羧甲基纤维素钠（1.5 mL）的试管，与柠檬酸缓冲液（1.5 mL）和粗酶液（0.5 mL）在50°C水浴中孵育60分钟（CMCase）或30分钟（FPase）。随后向混合物中加入DNS试剂（1.5 mL），在水浴中煮沸5分钟。使用葡萄糖标准曲线在540 nm波长处测定还原糖含量。
【数据】羧甲基纤维素钠浓度：1%（w/v）；羧甲基纤维素钠体积：1.5 mL；柠檬酸缓冲液体积：1.5 mL；粗酶液体积：0.5 mL；水浴温度：50°C；CMCase孵育时间：60 min；FPase孵育时间：30 min；DNS试剂体积：1.5 mL；煮沸时间：5 min；检测波长：540 nm
2.3 堆肥实验设计
实验材料包括大豆秸秆、牛粪和酒糟。大豆秸秆和牛粪由金兴农业有限公司提供，酒糟来源于齐鲁工业大学中德啤酒技术中心。这些材料的主要理化性质见表1。实验采用泡沫保温箱（33 × 22 × 23 cm³）作为容器。将秸秆切成小段（长度<2 cm），然后与牛粪和酒糟按1:2:2的比例混合。含水量调整为60%。实验分为三组：对照组（CK）、接种组（In）和接种覆膜处理组（InC）。分组依据见Text S4。In和InC的接种剂量均为3 × 10⁹ CFU/kg，而CK则以LB培养基替代接种。CK和In保持露天条件，InC则密封以模拟覆膜条件，仅在采样时打开。每天12:00和18:00使用温度计记录堆体中心温度。在第0、3、7、14、21、28和35天进行翻堆。每次翻堆后，手动混合并采集样品。每个样品（0.2 kg）分为两部分：一部分干燥、研磨后进行理化分析，另一部分储存在−80°C用于微生物测序和后续分析（Dong et al., 2024b）。
【数据】容器尺寸：33 × 22 × 23 cm³；秸秆长度：<2 cm；混合比例：秸秆:牛粪:酒糟 = 1:2:2；含水量：60%；接种剂量：3 × 10⁹ CFU/kg；温度记录时间：每日12:00和18:00；翻堆天数：0、3、7、14、21、28、35天；样品量：0.2 kg；储存温度：−80°C
2.4 堆肥理化指标测定
为测定pH和电导率（EC），将新鲜样品按1:10（w/v）比例悬浮于超纯水中，在摇床上以180 rpm振荡30分钟。随后使用多功能仪器（MT3100M, Ohaus, 常州, 中国）测定pH和EC值（Yang and Zhang, 2022）。总氮（TN）和总碳（TC）的测定使用全自动高灵敏度元素分析仪（Elementar Vario PYRO cube, Elementar, 德国）。铵态氮（NH₄⁺-N）和硝态氮（NO₃⁻-N）含量使用流动分析仪（FIAstar 5000, FOSS, 瑞典）测定。初始和最终阶段的纤维素、半纤维素和木质素含量使用超高效液相色谱仪按照NREL实验室分析规程（生物质中结构碳水化合物和木质素的测定）进行评估。
【数据】样品与水比例：1:10（w/v）；振荡转速：180 rpm；振荡时间：30 min；仪器型号：MT3100M（Ohaus）；元素分析仪：Elementar Vario PYRO cube；流动分析仪：FIAstar 5000（FOSS）；纤维素/半纤维素/木质素检测方法：NREL Laboratory Analytical Procedure
2.5 堆肥微生物分析
使用FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals, Solon, OH, 美国）从收集的堆肥样品中提取总基因组DNA（Zhou et al., 2024）。使用引物338 F（5′-barcode + ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rRNA。16S rRNA基因测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。序列在97%相似度阈值下聚类为操作分类单元（OTUs）。交互分析在美吉生物医药科技有限公司环境微生物多样性云交互平台（上海美吉生物医药科技有限公司）上进行。微生物测序分析详情见Text S5。原始测序读长已存入NCBI Sequence Read Archive（SRA）数据库（登录号：PRJNA1456946）。
【数据】DNA提取试剂盒：FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals）；正向引物：338 F；反向引物：806 R；OTU聚类相似度阈值：97%；测序公司：上海生工生物工程股份有限公司；数据库登录号：PRJNA1456946
2.6 统计分析
统计分析使用JASP 0.19进行，图表使用GraphPad Prism 8.0.2和Origin 2021创建。微生物分析和可视化使用美吉云平台进行。
【数据】统计软件：JASP 0.19；绘图软件：GraphPad Prism 8.0.2、Origin 2021；微生物分析平台：美吉云平台
研究结果
3.1 协同细菌群落及其共降解效果
基于耐温性、降解能力（纤维素、蛋白质、淀粉和脂质）及滤纸降解率的筛选，由DF-1、DF-8和DF-22组成的组合命名为YB1，其秸秆降解率最高，达到27.20%，优于单株菌和其他多株菌组合（图1a）。形态学和分子生物学鉴定（图1b-1c）证实，YB1由Bacillus sonorensis（DF-1）、Bacillus licheniformis（DF-8）和Bacillus subtilis（DF-22）组成。这些菌株的菌落边缘不规则、呈白色，属于短杆状革兰氏阳性菌（2–3 μm），与芽孢杆菌属的典型形态特征一致。通过比较单株菌与合成菌群的纤维素酶活性，验证了YB1的协同效应（图1d-1e）。YB1的FPase和CMCase活性分别达到4.26 U/mL和23.27 U/mL，显著高于各单株菌。这些结果与先前研究一致（Baltaci, 2022; Wang et al., 2022），进一步证明合成微生物群落比纯单株培养物具有更大的降解潜力。基于文献报道的芽孢杆菌功能特征，YB1的协同作用可能涉及以下推测性协同途径：1）代谢协同：据报道B. licheniformis分泌β-葡聚糖酶，将纤维素水解为纤维二糖（Bajestani et al., 2017），纤维二糖可作为B. sonorensis和B. subtilis所产纤维素酶的底物和诱导物（de Araújo et al., 2019）；2）胞外酶稳定化：B. sonorensis合成的胞外聚合物（EPS）已被证明能形成保护性基质，增强水解酶在≤70°C条件下的热稳定性（Kayoumu et al., 2025）；3）抗逆协同：来自B. sonorensis的sonorensin、来自B. licheniformis的杆菌肽和来自B. subtilis的表面活性素协同抑制病原菌，提高环境适应性（Bolocan et al., 2017）。这些文献支持的相互作用提示了一个功能网络：DF-8启动底物分解，DF-1在热胁迫下维持酶效力，集体抗生作用减少生态竞争——共同解释了YB1增强的纤维素分解活性（图1e）。合成细菌群落YB1用于后续堆肥实验。
【数据】YB1秸秆降解率：27.20%；菌株组成：Bacillus sonorensis DF-1、Bacillus licheniformis DF-8、Bacillus subtilis DF-22；菌体形态：短杆状革兰氏阳性菌，2–3 μm；FPase活性：4.26 U/mL；CMCase活性：23.27 U/mL；EPS热稳定温度：≤70°C
3.2 YB1对堆肥理化性质的影响
3.2.1 温度、pH、EC和C/N动态
堆肥理化指标（温度、pH、EC）调控微生物群落演替和产品质量（Xi et al., 2016）。为全面评估不同处理下的堆肥性能和腐熟特征，在整个堆肥期间持续监测关键理化参数。温度直接反映堆肥进程和腐熟度。如图2a所示，YB1接种（In）使峰值温度较对照组（CK）提高4°C，>60°C持续时间延长5天。然而，在InC覆膜条件下，产热受到一定抑制。CK和In的pH值呈现相似趋势（图2b）。In的pH较CK提前4天下降，表明YB1接种促进了有机质分解为有机酸，加速了堆肥进程。InC中pH的持续上升与覆膜堆肥系统一致（Wang et al., 2024a），可能是由于减少了氨排放。EC是堆肥腐熟度的指标之一。所有处理的EC呈现相似趋势（图2c），但In的峰值更高且比CK提前7天出现。据报道，EC值低于4 mS/cm表明堆肥腐熟（Kumar Awasthi et al., 2017）。CK、In和InC的最终EC值分别为4.27、3.46和3.63 mS/cm，表明YB1接种提高了堆肥腐熟度。C/N比可反映堆肥物质的动态变化。与CK相比，In中C/N比的下降反映了微生物氮积累（图2d）。相反，InC在第7至21天之间C/N比升高，总碳含量从371.12 g/kg上升至428.78 g/kg，总氮含量从29.58 g/kg下降至24.15 g/kg。这种现象可能是由于氧气流动受限阻碍了硝化作用并增加了氮损失（Xu et al., 2024）。
【数据】In峰值温度较CK提高：4°C；In高温期（>60°C）较CK延长：5天；In的pH较CK提前下降：4天；In的EC峰值较CK提前：7天；CK最终EC：4.27 mS/cm；In最终EC：3.46 mS/cm；InC最终EC：3.63 mS/cm；InC第7-21天总碳变化：371.12 → 428.78 g/kg；InC第7-21天总氮变化：29.58 → 24.15 g/kg；腐熟EC阈值：<4 mS/cm
3.2.2 木质纤维素降解与氮转化
木质纤维素降解是堆肥过程中的重大挑战。YB1显著增强了纤维素降解（In: 74.08% vs. CK: 60.31%）和半纤维素降解（In: 70.97% vs. CK: 49.44%），为腐殖质形成提供前体，并作为微生物的碳源。相比之下，InC增加了木质素降解但抑制了纤维素水解。这与Wang的研究一致，即覆膜阻碍了与纤维素降解相关的微生物和酶，但促进了降解木质素的酶的产生（Wang et al., 2024a）。需要指出的是，InC处理中产热受限和纤维素降解受抑制并非覆膜的普遍负面效应，而是与本研究中使用的实验室小规模静态堆肥系统和不透气覆盖材料密切相关。在实际大规模农业堆肥中，通常采用透气膜或强制通风。这些做法在保持热量和水分的同时，维持充足的氧气供应和微生物活性。因此，本研究结果并不否定覆膜在堆肥中的价值（Sun et al., 2024）。相反，它们表明微生物接种与覆膜结合的效率高度依赖于覆膜材料和通风条件。堆肥过程中，NH₄⁺-N和NO₃⁻-N的动态变化代表了核心氮转化途径，反映了有机氮矿化和堆肥腐熟进程（Hoang et al., 2022）。在In组中，NH₄⁺-N在第7天达到最大值7640 mg/kg，同步对应同一阶段最高的总氮含量33.86 g/kg。这一现象表明，YB1接种有效促进了堆肥高温期的有机氮矿化，强化了有机质分解。In组中NO₃⁻-N从第7天到第21天的急剧积累进一步验证了YB1添加促进了硝化过程并推进了堆肥腐熟。相比之下，InC组表现出不同的无机氮变化模式。NO₃⁻-N浓度从第7天到第21天快速下降，然后在堆肥后期缓慢上升。堆肥结束时，InC维持了相对较高的NH₄⁺-N但较低的NO₃⁻-N含量，这与其C/N比的变化特征高度一致。覆膜处理通过形成相对低氧和温和温度的内部微气候重塑了微环境条件，从而减缓了硝化作用并延迟了整体堆肥腐熟进程。此外，InC在第35天较高的残留NH₄⁺-N含量可通过覆膜效应合理解释：覆盖材料上的冷凝水膜捕获气态NH₃，被截留的氮物质在重力作用下回流至堆体中，最终在系统中保留了更多的铵态氮（Ma et al., 2021）。
【数据】In纤维素降解率：74.08%；CK纤维素降解率：60.31%；In半纤维素降解率：70.97%；CK半纤维素降解率：49.44%；In NH₄⁺-N最大值：7640 mg/kg（第7天）；In总氮最高含量：33.86 g/kg（第7天）；NO₃⁻-N急剧积累时段：第7-21天（In组）；InC NO₃⁻-N下降时段：第7-21天
3.3 YB1对堆肥中细菌群落的影响
3.3.1 α多样性动态
微生物群落的动态变化可通过物种丰度和多样性指数的变化有效表征。如表2所示，覆盖度指数……
【数据】原文未详述（该段原文在"coverage inde"处截断）
讨论与解读
本研究以耐高温和降解能力为首要筛选目标，从堆肥样品中筛选构建了合成细菌群落YB1，由Bacillus sonorensis DF-1（CGMCC No. 30858）、Bacillus licheniformis DF-8（CGMCC No. 30859）和Bacillus subtilis DF-22（CGMCC No. 30860）组成。YB1在纤维素降解中表现出显著协同效应。应用于大豆秸秆堆肥时，YB1显著提高了堆体温度和持续时间，纤维素和半纤维素降解率分别提升13.77%和21.53%。YB1影响了堆肥内微生物群落的演替，芽孢杆菌在整个堆肥过程中保持优势地位。芽孢杆菌属与Saccharomonospora、Novibacillus、Ureibacillus、Thermoactinomyces等形成功能性降解模块。然而，由于厌氧环境的影响，InC组除提高木质素降解率外未表现出显著优势。功能预测表明，接种YB1可能通过富集与氮保留和木质纤维素降解相关的微生物功能，增强了堆肥过程中的碳氮转化。这些发现为应用协同合成微生物群落实现农业废弃物资源化提供了实践指导。
编译者解读
该研究的亮点在于从堆肥原位环境筛选耐高温芽孢杆菌并理性构建三菌株合成菌群，验证了"代谢协同—酶稳定—抗逆"的多层次协同假说。YB1在提升堆肥温度和加速木质纤维素降解方面数据扎实，尤其是高温期延长5天为嗜热降解菌提供了更长的作用窗口。但研究局限也较明显：InC覆膜组因实验室规模限制未能体现覆膜在实际生产中的优势，且功能预测基于PICRUSt2推断而非宏基因组或蛋白组验证。未来若能结合多组学解析菌群互作机制，并在中试规模堆肥中验证，将更具推广价值。
参考来源
期刊：Environmental Technology & Innovation, 2026
DOI: 10.1016/j.eti.2026.105005
DOI: 10.1016/j.eti.2026.105005