来源：Surface plasmon resonance biosensor with plastic-binding peptide for nanoplastic detection in environmental water（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
纳米塑料（1–1000 nm）已成为广受关注的新兴环境污染物，但其可靠检测受限于颗粒尺寸极小、缺乏特异性识别元件。本研究提出一种基于表面等离子体共振（SPR）的生物传感器，以聚苯乙烯结合肽（PS-BP，序列 VHWDFRQWWQPS）作为识别元件，实现对50 nm聚苯乙烯纳米颗粒（PS-NPs）的选择性、无标记检测。在离子调节实验室水中，20分钟内检测限达1.3 μg/mL；在过滤水族箱水和池塘水加标实验中同样实现了检测。该工作首次将塑料结合肽与传播型SPR光谱联用，为纳米塑料的环境监测提供了新路径。
研究背景
塑料制品的大规模使用导致微小塑料颗粒从家庭垃圾、工业活动等多种来源进入海洋、河流、大气和土壤。纳米塑料指尺寸在1–1000 nm之间的塑料颗粒，具有胶体行为，主要由较大塑料降解或塑料材料制造过程中无意产生。尽管小于1000 nm的纳米塑料被认为已广泛存在于环境中，但受限于现有分析技术，其实际检出率可能远低于真实水平。毒理学研究已在水生生物和人类细胞系中揭示塑料纳米颗粒的有害效应，因此亟需开发可靠、灵敏的纳米塑料检测方法。
对于环境样品中的微塑料，目前已有多种分析技术正在建立，如过滤收集后经荧光显微镜、红外显微镜等手段分析。但纳米塑料因尺寸更小、浓度更低，检测难度显著增加。本研究选择聚苯乙烯纳米颗粒作为模型靶标，利用已有的聚苯乙烯结合肽（PS-BP）作为生物识别元件，结合SPR技术实现无标记检测，并进一步在模拟自然水体中验证其适用性。
研究方法
2.1 材料
聚苯乙烯纳米颗粒（PS-NPs，micromer，plain，直径50 nm）、二氧化硅纳米颗粒（SiO2-NPs，sicastar，plain，直径50 nm）和聚乳酸纳米颗粒（PLA-NPs，plain，直径250 nm）购自Micromod。聚苯乙烯结合肽（PS-BP），序列VHWDFRQWWQPS（PB-TUP），由GenScript合成。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐（sNHS）、Lipoamido-PEG12-COOH、2-吗啉乙磺酸（MES）、2-氨基乙醇购自东京化成工业株式会社。三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）购自Sigma-Aldrich。氯化钾、二水氯化钙、碳酸氢钠和七水硫酸镁购自关东化学株式会社。所有化学品均直接使用，未经进一步纯化。
【数据】PS-NPs：直径50 nm；SiO2-NPs：直径50 nm；PLA-NPs：直径250 nm；PS-BP序列：VHWDFRQWWQPS；试剂来源：Micromod、GenScript、东京化成工业、Sigma-Aldrich、关东化学
2.2 SPR传感器基底的制备
使用真空蒸发器在玻璃基底上沉积47 nm厚的平面金（Au）膜，玻璃与Au之间设置薄铬（Cr）粘附层。在进一步化学修饰之前，使用等离子清洗机清洗传感器基底表面10分钟。随后将传感器基底浸入含5 mM TCEP的1.0 mM Lipoamido-PEG12-COOH超纯水溶液中24小时，将Lipoamido-PEG12-COOH分子锚定到Au表面。传感器表面用乙醇和超纯水冲洗。基底干燥后真空保存以备后续实验。
【数据】Au膜厚度：47 nm；等离子清洗时间：10 min；Lipoamido-PEG12-COOH浓度：1.0 mM；TCEP浓度：5 mM；浸泡时间：24 h；清洗溶剂：乙醇、超纯水
2.3 光学测量
使用实验室自建的SPR光谱仪进行光学测量，详见支持信息中的Fig. S1。简言之，该SPR光谱仪基于Kretschmann配置的棱镜耦合方案。使用折射率匹配油将传感器基底贴附在由高折射率玻璃制成的三角棱镜上。在传感器表面安装流通池后，将棱镜头安装在电动旋转台上以调节入射角。p偏振He-Ne激光（λ = 632.8 nm）从棱镜侧入射，反射强度由光电探测器测量。通过扫描入射角获取SPR曲线。动力学测量在略低于共振角的固定入射角下进行。使用LabVIEW控制旋转台并测量反射率。
【数据】激光波长：632.8 nm；偏振：p偏振；光源：He-Ne激光；控制软件：LabVIEW；配置：Kretschmann棱镜耦合
2.4 样品制备
为评估纳米塑料SPR生物传感器的传感性能，制备了三种模拟淡水组成的水溶液：离子调节实验室水、水族箱水和池塘水。离子调节实验室水含有支持信息中Table S1所列的淡水离子。为使含PS-NPs的水样更接近自然水体，同时确保其组成已知且可控，实验中构建了容量为4 L的水生模拟微生态系统。生态系统中的水由去离子水添加Table S1所列的CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3和KCl组成。初始条件为pH调节至7.0 ± 0.5，溶解氧（DO）维持在6 ± 1 mg/L。实验温度保持在25 ± 1 °C，光照强度5000–5500 xl，光暗周期12h/12h。微生态系统中投放的生物包括：作为生产者的小球藻和绿眼虫，作为初级消费者的尾草履虫和溞，作为次级消费者的斑马鱼，以及执行分解功能的细菌和真菌（包括酵母、光合细菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌）。水族箱维持3个月以上至稳定后方可采样。池塘水取自东京大冈山校区附近的洗足池。水样采集于2024年11月至2025年3月间进行。水族箱水和池塘水经过滤去除微米级以上的杂质。水族箱水和池塘水的水质指标如pH、电导率（EC）、DO、化学需氧量（COD）、生化需氧量（BOD）、总氮（TN）和总磷（TP）经分析后汇总于支持信息Table S2。
【数据】微生态系统容量：4 L；pH：7.0 ± 0.5；DO：6 ± 1 mg/L；温度：25 ± 1 °C；光照强度：5000–5500 xl；光暗周期：12h/12h；水族箱稳定时间：>3个月；采样时间：2024年11月–2025年3月；盐类：CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3、KCl
2.5 检测方案
表面功能化过程和PS-NP检测方案如图1所示。
首先，记录PEG-COOH修饰的传感器基底在水中的角度SPR曲线以确定共振角。在略低于共振角的固定入射角下进行动力学测量。监测反射强度5分钟以获得基线。以50 mM MES缓冲液（pH 5.5）冲洗5分钟，然后用EDC/sNHS溶液（200/50 mM，溶于MES缓冲液）活化传感器表面12分钟。随后用10 mM MES缓冲液冲洗表面1分钟。然后引入浓度为100 μg/mL的PS-BP溶液（溶于10 mM MES缓冲液）并孵育20分钟。之后用MES缓冲液冲洗传感器表面3分钟。剩余活性位点用乙醇胺（1 M，pH 8.5）封闭20分钟，随后用超纯水冲洗。在超纯水中采集基线后，引入加标PS-NPs的样品溶液，以1 mL/min的流速循环20分钟。设置20分钟持续时间是为了在当前实验配置下获得足够清晰的PS-NP检测SPR信号。PS-NPs的悬浮介质为离子调节实验室水、过滤水族箱水或过滤池塘水。最后，用超纯水冲洗传感器表面。在每个步骤采集角度SPR曲线，以估算固定的PS-BP和PS-NPs的量。对于选择性分析，分析了SiO2-NPs和PLA-NPs的悬浮液。使用Winspall软件（Resonant Technologies GmbH）分析SPR曲线。使用不同的传感器基底重复测量至少三次。传感器重现性通过批间（芯片间）测量评估，并以误差棒形式呈现于图中。
【数据】MES缓冲液浓度：50 mM（pH 5.5）和10 mM；冲洗时间：5 min和1 min；EDC/sNHS浓度：200/50 mM；活化时间：12 min；PS-BP浓度：100 μg/mL；PS-BP孵育时间：20 min；MES冲洗时间：3 min；乙醇胺浓度：1 M（pH 8.5）；封闭时间：20 min；样品循环时间：20 min；流速：1 mL/min；重复次数：至少3次
2.6 SEM观察
SPR测量后，使用FE-SEM（场发射扫描电子显微镜，Hitachi High-Tech FE-SEM，S-5500）观察附着在传感器基底上的PS-NPs。传感器基底用超纯水冲洗，然后在空气中干燥。SEM观察前溅射薄Pt层（Hitachi MC1000离子溅射镀膜机）。使用ImageJ（https://imagej.net/ij/）分析SEM图像。
【数据】SEM型号：Hitachi High-Tech FE-SEM S-5500；溅射设备：Hitachi MC1000；图像分析软件：ImageJ；Pt层：薄层溅射
研究结果
3.1 PS-BP功能化传感器基底对PS-NPs的检测
首先研究了PS-BP在SPR传感器表面的固定，然后进行PS-NPs的检测。图2(a)显示了在超纯水中，结合PS-BP和PS-NPs前后采集的一系列SPR曲线。在表面活化、PS-BP固定和后续PS-NPs检测过程中，动力学测量在55.5度的入射角下进行，分别如图2b和c所示。
如图2b所示，由于缓冲溶液切换引起的折射率差异，反射率发生剧烈变化。相比之下，当在t = 28分钟引入PS-BP溶液时，反射率逐渐增加，并在注入后约15分钟达到饱和。虽然用MES缓冲液冲洗时观察到反射率略有下降，但图2b中总体反射率呈增加趋势。结合图2a所示的共振角偏移，这些结果表明PS-BP结合到了传感器表面。固定的PS-BP量通过拟合SPR曲线估算为表面质量密度增量ΔΓ，由以下方程描述：ΔΓ = d × (np − nw)/(dn/dc)，其中d为通过SPR曲线拟合获得的肽层厚度，dn/dc为折射率增量，np和nw分别为肽和水的折射率。折射率np及其增量（dn/dc）分别假定为1.5和0.182 μg/mL，作为蛋白质和肽的典型值。PS-BP结合引起的ΔΓ估算为1.1 ± 0.2 ng/mm²。在固定完整蛋白质（如IgG）的情况下，已有报道表面质量密度增加2.4 ng/mm²。考虑到分子量的差异，我们推断固定的肽量是充足的。
随后进行了PS-NPs的检测。图2(c)显示了悬浮在离子调节实验室水中浓度为100 μg/mL的PS-NPs的动力学测量。引入样品溶液后，反射率立即开始变化，在随后的20分钟内增加了约10%。用水冲洗传感器表面后反射率仅略微下降，表明PS-NPs仍结合在传感器表面上。图2(a)的SPR角度曲线中观察到明显的共振角偏移。该偏移表明传感器基底表面折射率的变化，归因于PS-NPs的结合。相反，共振角处的总体反射率变化较小，这意味着PS-NPs引起的散射效应不显著。
【数据】入射角：55.5度；PS-BP引入时间：t = 28 min；饱和时间：约15 min；PS-BP固定量ΔΓ：1.1 ± 0.2 ng/mm²；np：1.5；dn/dc：0.182 μg/mL；PS-NPs浓度：100 μg/mL；反射率增加：约10%；检测时间：20 min；IgG参考表面质量密度：2.4 ng/mm²
3.2 PS-BP的结合特性
接下来研究了PS-BP作为PS-NPs识别元件的基本特性。首先评估了PS-BP捕获PS-NPs的能力。图3a显示了将PS-NP悬浮液（10 μg/mL）注入有和无PS-BP固定的PEG-COOH修饰传感器表面后获得的动力学测量结果。
仅在PS-BP功能化表面上，注入后立即观察到反射率的明显增加，而无PS-BP时反射率变化可忽略不计。这些结果表明，PS-NPs的非特异性结合在PEG修饰表面上被有效抑制，证实了传感器表面上PS-NPs的结合是由PS-BP介导的。随后研究了PB-TUP的选择性。图3b显示了三种独立介电纳米颗粒悬浮液——PS、SiO2和PLA——在固定浓度10 μg/mL下的传感器信号。选择PLA作为常用塑料的代表，SiO2作为淡水中天然丰富的组分。如图3b所示，与PS-NPs相比，注入PLA-NPs和SiO2-NPs悬浮液后反射率变化显著被抑制。图3c展示了有和无PS-BP固定基底上PS-、SiO2-和PLA-NPs的传感器信号（ΔRs，定义见图3b）比较，该信号代表水冲洗后的反射率变化。无论纳米颗粒材料如何，无PS-BP的传感器表面均表现出较低信号，证明了PEG链对介电纳米颗粒的抗污特性。相反，仅在PS-BP修饰表面上观察到PS-NPs的显著信号，表明PS-BP对PS-NPs的选择性。此处需注意，PLA-NPs的直径（250 nm）大于PS-和SiO2-NPs。因此，PLA-NPs的传感器响应可能反映了材料和尺寸双重效应的组合。
【数据】PS-NP浓度：10 μg/mL；SiO2-NP浓度：10 μg/mL；PLA-NP浓度：10 μg/mL；PLA-NP直径：250 nm；PS-NP直径：50 nm；SiO2-NP直径：50 nm
3.3 PS-NPs检测限的确定
接下来研究了所开发SPR生物传感器的传感性能，重点关注PS-NPs检测限的确定。在该实验中，PS-NP浓度C PS-NP从0.1变化到1000 μg/mL以获得校准曲线。图4a显示了不同浓度PS-NPs悬浮液的代表性传感器响应。
在引入样品溶液前测量基线以确定传感器信号的标准偏差（σ）。对于空白样品（PS-NP浓度 = 0 μg/mL），由于纯水和离子调节实验室水之间的微小折射率差异，注入样品溶液后反射率略有变化。随后用纯水冲洗恢复了基线反射率。在含PS-NPs的样品溶液中，反射率与PS-NP浓度成比例增加。用超纯水冲洗传感器表面后，记录反射率增量，在图4a中记为ΔRs。图4b显示了PS-NP检测的校准曲线，绘制ΔRs作为PS-NP浓度C PS-NP的函数。图4b中的误差棒代表在不同传感器基底上进行的至少三次独立测量的标准偏差。如图4b所示，传感器信号在PS-NP浓度高于3 μg/mL时开始增加。在较高PS-NP浓度下，信号增加速率减慢。由于PS-BP与PS-NPs之间的基础结合机制尚不清楚，我们使用对PS-NP浓度呈线性响应的传感器信号来评估检测限，而非应用假设1:1结合的Langmuir等温线模型。图4c展示了从图4b重新绘制的校准曲线。传感器信号用线性函数拟合以确定斜率和截距。通过将传感器信号标准偏差的三倍（3σ = 0.052%）代入线性拟合函数，PS-NPs的检测限估算为1.3 μg/mL。图4c所示线性回归的决定系数（R²）为0.998，表明与实验数据拟合良好。变异系数（CV）由各浓度下传感器信号的标准偏差（S）和均值（x̄）评估如下：(2) CV(%) = S/x̄ × 100。结果汇总于支持信息Table S3。在LOD以上浓度，CV值在20–30%范围内。每次测量使用不同的传感器基底可能导致观察到的变异。
通过拟合SPR曲线和分析SEM图像进一步量化了吸附在传感器表面上的PS-NPs量。简言之，暴露于浓度为1、3、30、100和1000 μg/mL的PS-NP悬浮液后的SPR传感器基底在SPR测量后通过SEM观察，如实验部分所述。图5a–d显示了PS-NP浓度为1、3、30、100和1000 μg/mL下SPR测量后传感器基底的SEM图像。
【数据】PS-NP浓度范围：0.1–1000 μg/mL；空白样品浓度：0 μg/mL；LOD：1.3 μg/mL；3σ：0.052%；R²：0.998；CV范围：20–30%；SEM观察浓度：1、3、30、100、1000 μg/mL；信号起始增加浓度：>3 μg/mL
讨论与解读
本研究提出了一种以PS-BP为识别元件的SPR生物传感器，用于检测50 nm聚苯乙烯纳米颗粒。对照实验证明了PS-BP对PS-NPs的选择性和亲和力。首次利用SPR曲线拟合和扫描电子显微镜对传感器基底上PS-NP的结合进行了定量分析。在离子调节实验室水中，无需额外标记，20分钟分析周期内PS-NPs的检测限达到1.3 μg/mL。最后，通过在过滤水族箱水和池塘水中加标PS-NPs验证了检测可行性。传播型SPR光谱的定量表征结合对照实验，凸显了PS-BP作为纳米塑料识别元件的潜力，可加速开发适用于水生环境的纳米塑料生物传感器，并有望在未来研究中扩展至生物样品。
编译者解读：该工作的核心创新在于将噬菌体展示筛选获得的塑料结合肽从“材料粘附”语境迁移到“环境传感”语境，用生物识别替代了纳米塑料检测中惯用的光谱指纹或质谱方法。PS-BP对PS的选择性优于SiO2和PLA，且PEG背景抗污策略有效降低了非特异性吸附，这是SPR传感在复杂基质中可用的前提。但需注意，1.3 μg/mL的LOD距环境实际浓度仍有数量级差距，且PLA-NPs的尺寸混杂效应未被完全解耦。未来若将PS-BP与微流控富集或纳米颗粒计数技术联用，或可突破灵敏度瓶颈。
参考来源
期刊：Biosensors and Bioelectronics, 2026
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118748
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118748