来源：From heterotrophic monoculture to light-driven coculture: A sustainable platform for PHA biosynthesis and insights into interspecies metabolic interactions（Environmental Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是石油基塑料的理想替代品，但高昂的生产成本限制了其商业化。本研究构建了由光合蓝细菌 Synechococcus elongatus PCC 7942 与异养菌 Priestia aryabhattai GM3 组成的合成菌群，直接以CO₂为原料生产聚羟基丁酸酯（PHB）。通过转录组解析、共培养条件优化和物理分隔实验，团队将PHB产量提升至102 mg/L，并揭示了氨基酸、二肽、碳水化合物和辅因子等代谢物交叉喂养对菌群稳定性的关键作用。
研究背景
PHA是一类可生物降解、生物相容的聚酯，性能可与传统石油基塑料媲美（Park et al., 2024）。然而，微生物法生产PHA的成本居高不下，主要原因在于依赖有机底物、碳转化效率不理想以及生物过程控制要求严苛（Bhatia et al., 2021）。要突破这些瓶颈，需要将PHA合成与昂贵原料脱钩，同时实现高效碳利用。
光合-异养共培养系统为此提供了新路径：微藻或蓝细菌将CO₂和光能转化为有机酸或碳水化合物，供异养伙伴直接利用，从而大幅降低对有机原料的依赖。例如，工程改造的 Chlamydomonas reinhardtii 可分泌乙醇酸支持大肠杆菌生长和番茄红素合成，同时提高整体碳转化效率（Kang et al., 2025）。类似地，由工程 Synechococcus sp. PCC 7002 和解脂耶氏酵母组成的光驱动菌群也实现了可持续生产。
研究方法
2.1 微生物菌株
光合伙伴为工程蓝细菌菌株 S. elongatus PCC 7942，来自前期研究（Bai et al., 2025a）。异养伙伴 Priestia aryabhattai GM3 为实验室保藏菌株，具有PHB生产能力（Bai et al., 2026）。共培养培养基基于蓝细菌BG11培养基，补充150 mM NaCl。
【数据】菌株：S. elongatus PCC 7942（光合）、P. aryabhattai GM3（异养）；培养基：BG11 + 150 mM NaCl；原文未详述其他成分
2.2 转录组测序与分析
将 P. aryabhattai 接种于PHA生产培养基（Bai et al., 2025b）中，30 °C、180 rpm振荡培养48 h。蔗糖作为唯一碳源，浓度分别为30 g/L或5 g/L。离心收集细胞，送至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序。每种条件设三个生物学重复。Clean reads比对至NCBI参考基因组（组装号ASM268860v1）。差异基因表达分析采用DEGseq2，以低蔗糖条件为参照。以Padj < 0.05且|log2FC| ≥ 1为显著差异表达基因的判定标准。
【数据】培养温度：30 °C；转速：180 rpm；时间：48 h；蔗糖浓度：30 g/L或5 g/L；生物学重复：3个；差异基因标准：Padj < 0.05，|log2FC| ≥ 1；参考基因组：ASM268860v1
2.3 共培养条件优化
评估初始pH、异养菌接种量、酵母提取物补充量和异养菌接种时机对共培养条件的影响。共培养培养基pH调整至6.5–8.5范围。共培养前，光合伙伴在共培养培养基中扩培三天。随后将异养伙伴按不同接种比例接入分泌蔗糖的蓝细菌培养液中。此外，测试不同浓度的酵母提取物和不同 P. aryabhattai 接入时机对生物量生长的影响。所有实验在50 mL工作体积中进行，温度30 °C，连续光照（2500 Lux），180 rpm振荡。
【数据】pH范围：6.5–8.5；光合伙伴预培养时间：3天；工作体积：50 mL；温度：30 °C；光照：2500 Lux；转速：180 rpm
2.4 生物量与PHB产量表征
离心收集细胞，冻干过夜以测定细胞干重（DCW）。S. elongatus 干重通过细胞数与干重的标准曲线估算（DCW = 1.5520 × 10⁻⁹ × 细胞数 + 0.0402）。细胞数用流式细胞仪（A60 micro plus，Apogee Flow Systems，英国）定量。P. aryabhattai 干重由总DCW减去蓝细菌干重计算。PHA含量通过气相色谱-质谱联用（GCMS-QP2010 SE，SHIMADZU，日本）分析。PHA含量和产量计算公式如下：PHA含量（%）= mPHA/msample × 100%，PHA产量（g/L）= PHA含量 × DCW。
【数据】冻干时间：过夜；DCW标准曲线：DCW = 1.5520 × 10⁻⁹ × 细胞数 + 0.0402；仪器：流式细胞仪A60 micro plus、GCMS-QP2010 SE；公式：PHA含量（%）= mPHA/msample × 100%，PHA产量（g/L）= PHA含量 × DCW
2.5 Transwell和透析袋物理分隔实验
使用Transwell板（3450，Corning，美国）评估物理接触在 S. elongatus 与 P. aryabhattai 互作中的作用。Transwell共培养实验装置见图3A。在物理分隔共培养中，两个伙伴被0.4 μm孔径的聚酯膜插件隔开，该膜允许代谢物交换但阻止细胞在隔室间通过（Sun et al., 2022a）。S. elongatus 和 P. aryabhattai 分别培养于顶室（2.5 mL共培养培养基）和底室（3 mL共培养培养基）。有物理接触的共培养在无插件的孔中进行，含5.5 mL共培养培养基。每组设三个生物学重复。共培养四天后，监测 S. elongatus 和 P. aryabhattai 的细胞数。
透析袋（MD10-14，Viskase，美国）用于在摇瓶规模评估物理接触在两者互作中的作用。实验装置见图3A。透析袋截留分子量为14 kDa，允许代谢物交换但阻止微生物细胞穿过膜（Ma et al., 2022）。使用前，透析袋剪成10 cm长片段，活化并灭菌。P. aryabhattai 培养于透析袋内，S. elongatus 培养于周围培养基中。有直接物理接触的共培养在50 mL工作体积中不使用透析袋进行。每种条件设三个生物学重复。共培养四天后，测定 S. elongatus 和 P. aryabhattai 的细胞数、DCW和PHB产量。
【数据】Transwell膜孔径：0.4 μm；顶室体积：2.5 mL；底室体积：3 mL；有接触组体积：5.5 mL；透析袋截留分子量：14 kDa；透析袋长度：10 cm；共培养时间：4天；生物学重复：3个；工作体积（摇瓶）：50 mL
2.6 代谢物补充实验与胞外代谢组学
P. aryabhattai 在补充0.5 g/L蔗糖作为碳源的共培养培养基中生长。将2 μL起始接种物加入96孔微板（3370，Corning，美国）中的200 μL共培养培养基中。使用酶标仪（SynergyH1，BioTek，美国）每小时测定OD600。S. elongatus 在以CO₂为碳源的共培养培养基中生长。将24 μL起始接种物加入96孔微板中的200 μL共培养培养基中，每4 h测定OD730。单个氨基酸补充浓度为1 mM，对照组不补充。每种条件设五个生物学重复。收集共培养和各单培养的上清液样品，冻干过夜后进行液相色谱-质谱分析（UHPLC-Q Exactive系统，Thermo Fisher Scientific，美国）。每种条件设六个生物学重复。差异代谢物基于OPLS-DA模型的变量投影重要性（VIP）评分结合Student's t检验p值鉴定。统计显著性定义为VIP > 1且p < 0.05。为评估潜在过拟合，进行200次置换检验，Q2截距低于零表示模型有效（Xiong et al., 2019）。
【数据】蔗糖浓度：0.5 g/L；接种体积：2 μL（P. aryabhattai）、24 μL（S. elongatus）；培养基体积：200 μL；OD测定间隔：1 h（OD600）、4 h（OD730）；氨基酸浓度：1 mM；生物学重复：5个（生长实验）、6个（代谢组学）；差异代谢物标准：VIP > 1，p < 0.05；置换检验次数：200
2.7 统计分析
所有测量值以三个生物学重复的平均值表示。统计显著性采用Student's t检验评估，p < 0.05视为具有统计学显著性。
【数据】生物学重复：3个；显著性阈值：p < 0.05；统计方法：Student's t检验
研究结果
3.1 PHB生物合成途径解析与氮源选择
由光合 S. elongatus 和异养 P. aryabhattai 组成的合成菌群此前已建立（Bai et al., 2026），可实现CO₂向PHB的生物转化。鉴于PHB生物合成归因于异养伙伴，本研究通过转录组测序解析其潜在生物合成途径和关键基因。主成分分析（PCA）显示各组内三个生物学重复清晰聚类（图S1）。在光驱动菌群中，异养 P. aryabhattai 完全依赖光合伙伴合成的蔗糖。为理解蔗糖如何流向PHB生产，通过高蔗糖和低蔗糖条件下的转录组分析检测了蔗糖到PHB的代谢途径（图1）。
P. aryabhattai 在30 g/L蔗糖培养时PHB产量达4.40 g/L，而5 g/L蔗糖条件下仅为0.15 g/L。转录组数据显示，负责蔗糖水解的基因显著上调（FC = 3.8），表明蔗糖向葡萄糖的转化增强。糖酵解关键限速酶，包括葡萄糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，均在转录水平被激活。其中上调最显著的基因CR091_RS07630的FC值为6.6，催化糖酵解末端步骤，增加丙酮酸供应。丙酮酸随后转化为乙酰辅酶A——生物量和PHB合成的中心中间体。下游将乙酰辅酶A转化为PHB的三个连续酶促步骤转录水平升高，FC值分别为2.8、9.2和9.2。这些转录模式表明高蔗糖可利用性将碳流导向PHB生物合成。P. aryabhattai 积累PHB以管理过量碳并维持胞内氧化还原稳态（Alloul et al., 2023）。这种协调响应凸显了其将蔗糖转化为储存性生物聚合物的能力，促进富蔗糖环境中的高效碳利用。
此外，鉴定了PHB生物合成的关键基因簇，揭示其在染色体上的连续排列。该簇中，phaB（CR091_RS06115）编码乙酰乙酰辅酶A还原酶，催化乙酰乙酰辅酶A还原为3-羟基丁酰辅酶A——PHB的直接前体。phaC（CR091_RS06120）编码PHB合酶，将3-羟基丁酰辅酶A聚合为PHB。调控碳流向PHB的PhaR（由CR091_RS06110编码）（Liu et al., 2015）转录水平也显著升高。促进颗粒形成的phasin蛋白PhaP（由CR091_RS06100编码）和感知胞内PHB状态的调控蛋白PhaQ（由CR091_RS06105编码）（Desetty et al., 2008）均强烈上调（FC > 10）。值得注意的是，phaR、phaB和phaC位于同一操纵子内，表明核心生物合成机器的协调转录。在PHB生物合成簇之外，编码胞内PHB解聚酶的phaZ（CR091_RS02465）显著下调（FC = −4.1）。总体而言，这些结果揭示了有利于PHB生物合成和储存而非降解的协调调控转变。此外，观察到的转录模式凸显了PHB生产菌株代谢工程的潜在策略，如过表达核心生物合成基因以增强PHB合成，结合抑制或删除解聚酶基因以防止生物聚合物降解，从而提高净PHB积累（Oh et al., 2023; Ranaivoarisoa et al., 2024）。
测试了四种氮源对异养生物量和PHB生产的影响（图S2）。酵母提取物在支持细胞生长和生物聚合物积累方面显著优于其他氮源（p < 0.0001）。P. aryabhattai 在有机氮源中表现优于无机氮源，可能归因于维生素和其他营养物质的存在（Park et al., 2023）。基于异养伙伴的氮源偏好，选择酵母提取物用于后续共培养研究，并优化了氮源可利用性。
【数据】PHB产量（30 g/L蔗糖）：4.40 g/L；PHB产量（5 g/L蔗糖）：0.15 g/L；蔗糖水解基因FC：3.8；CR091_RS07630 FC：6.6；乙酰辅酶A→PHB三步FC：2.8、9.2、9.2；phaP、phaQ FC：>10；phaZ FC：−4.1；酵母提取物vs其他氮源：p < 0.0001
3.2 共培养过程优化与PHB产量评估
为建立最优共培养条件，评估了pH、酵母提取物浓度、P. aryabhattai 接种量及其接种时机的影响（图2）。
pH对共培养生物量的影响见图2A。S. elongatus（0.31 g/L）和 P. aryabhattai（0.13 g/L）的最大生物量在pH 8.5时观察到。尽管总生物量随pH升高略有增加，共培养在pH 6.5至8.5的宽范围内保持稳定生长，表明适应性强。当 P. aryabhattai 接种量从0.1%增加至0.7%时，S. elongatus 和 P. aryabhattai 的生物量相应增加，分别达到最大值0.35 g/L和0.20 g/L（图2B）。当接种量进一步提高至0.9%时，P. aryabhattai 生物量不变，而 S. elongatus 生物量显著下降（p < 0.01）。初始异养接种量对共培养生长的重要性也得到相应叶绿素浓度测定的支持（Text S1；图S3）。氮源补充促进生物量积累（图2C）。添加1.4 g/L酵母提取物时，S. elongatus 最大生物量达0.61 g/L，显著高于无额外氮源时的0.35 g/L（p < 0.01）。酵母提取物浓度低于0.2 g/L不足以支持 P. aryabhattai 生长。然而，将氮源从0.6 g/L提高至1.4 g/L导致异养生物量显著增加（p < 0.01）。这些结果表明适度氮源补充有利于稳健的共培养生长。最后，优化了 P. aryabhattai 的接种时间（图2D）。第4天接种获得最高总生物量（0.84 g/L），显著高于第3天接种（12%；p < 0.05）。此时，S. elongatus 也达到最大生物量，两菌株生物量比达1:1，反映平衡分布。这些结果表明共培养性能受光合供应与异养需求之间平衡的塑造。碱性条件促进蓝细菌生长和蔗糖分泌增强，适度氮源补充主要支持异养生长（Ducat et al., 2012; Li et al., 2023）。此外，控制异养菌接种量并延迟其接入允许光合菌在异养消费开始前建立足够的生物量和蔗糖产量，使两个伙伴达到稳定互利的代谢状态。
基于优化的共培养条件，评估了合成菌群的PHB生产性能。最大PHB滴度和生产率分别达75.1 mg/L和33.6 mg/L/day，与优化前相比分别提高32%和52%（Bai et al., 2026）。已发表研究报道，S. elongatus 与 E. coli 共培养产生0.5 mg/L PHB，而 S. elongatus-Halomonas boliviensis 共培养达到28.3 mg/L/day（Hays et al., 2017; Weiss et al., 2017）。S. elongatus-P. putida 系统的最大滴度和生产率分别为156 mg/L和23.8 mg/L/day（Löwe et al., 2017）。这些结果确立了本研究中优化的 S. elongatus-P. aryabhattai 菌群作为高效PHB生产平台。尽管该系统表现出生长优势，但PHB含量相对于总生物量...
【数据】pH 8.5时 S. elongatus 生物量：0.31 g/L；pH 8.5时 P. aryabhattai 生物量：0.13 g/L；0.7%接种量时 S. elongatus 生物量：0.35 g/L；0.7%接种量时 P. aryabhattai 生物量：0.20 g/L；0.9%接种量时 S. elongatus 下降：p < 0.01；1.4 g/L酵母提取物时 S. elongatus 生物量：0.61 g/L；无额外氮源时：0.35 g/L（p < 0.01）；0.6→1.4 g/L氮源异养生物量增加：p < 0.01；第4天接种总生物量：0.84 g/L；第4天vs第3天：增加12%（p < 0.05）；最大PHB滴度：75.1 mg/L；最大生产率：33.6 mg/L/day；较优化前提升：32%和52%
3.3 物理分隔条件下的种间互作
为探究物理接触是否为菌群协作生长所必需，采用Transwell插件和透析袋进行物理分隔实验（图3A）。
在Transwell系统中，0.4 μm孔径的聚酯膜允许代谢物交换但阻止细胞通过。物理分隔条件下，两种微生物的细胞数比值（分隔/混合）如图3B所示。透析袋实验（14 kDa截留分子量）在摇瓶规模验证了物理分隔对互作的影响。物理分隔条件下，菌群的PHB产量进一步提高至102 mg/L。这些结果表明直接细胞接触并非协作生长的必要条件，代谢物交换足以维持菌群的协同生长和PHB生产。
【数据】Transwell膜孔径：0.4 μm；透析袋截留分子量：14 kDa；物理分隔下PHB产量：102 mg/L；共培养时间：4天
3.4 代谢物交换互作解析
为解析菌群中的代谢物交换关系，进行了基因组尺度代谢建模、靶向代谢物补充实验和非靶向胞外代谢组学分析（图4）。
P. aryabhattai 对精氨酸补充的生长响应见图4A。S. elongatus 对赖氨酸和谷氨酸补充的生长响应见图4B。精氨酸相关差异代谢物丰度见图4C。赖氨酸相关差异代谢物丰度见图4D。这些分析揭示了氨基酸、二肽、碳水化合物和辅因子的广泛交叉喂养，这些是共培养稳定性和代谢协调的必需营养物质。
【数据】氨基酸补充浓度：1 mM；精氨酸、赖氨酸、谷氨酸等代谢物差异标准：VIP > 1，p < 0.05
讨论与解读
本研究证明，光合-异养微生物合成菌群是生物聚合物生产的有效可持续平台。模块化、即插即用的设计允许 P. aryabhattai 被其他异养伙伴替换，用于合成多种化合物或降解环境污染物。重要的是，本研究强调了合成菌群内种间代谢互作的关键作用。虽然伙伴间的直接物理接触并非必需，但代谢物交叉喂养支撑了协作生长。这些发现为微生物生态互作提供了机制性见解，并为构建稳定、可控菌群提供了指导原则。未来研究将进一步探索如何利用代谢合作提高资源效率和目标生产率。
编译者解读：该研究以蓝细菌-异养菌合成菌群实现了CO₂到PHB的直接转化，75.1 mg/L的滴度在光驱动体系中处于中上水平，物理分隔后提升至102 mg/L更验证了代谢物交换的核心地位。转录组揭示的蔗糖→PHB通路及pha簇协调调控为代谢工程改造提供了明确靶点。不过，PHB含量相对总生物量仍偏低，且酵母提取物的添加削弱了"完全自养"的可持续性优势。未来若能用无机氮源替代并提高碳转化效率，该平台的工业化前景将更为可观。
参考来源
期刊：Environmental Research, 2026
DOI：10.1016/j.envres.2026.124886
DOI: 10.1016/j.envres.2026.124886