来源：Rapid acting α-transglucosidase from Aspergillus carbonarius: Cloning, characterization, in-silico analyses and synthesis of stable vitamin-C analogue using the recombinant enzyme（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗坏血酸（维生素C）稳定性差，易被氧化降解，限制了其在食品与化妆品领域的应用。将其糖基化生成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸（AA2G）是提升稳定性的有效策略。本研究从黑曲霉BTCF 5中克隆了一个GH31家族α-转葡糖苷酶，在Komagataella phaffii中异源表达，该重组酶在30分钟内即可催化抗坏血酸糖基化，AA2G产量达13 g/L，总生产率达26 g/L/h，为目前报道的最高值。分子对接与亚位点分析进一步揭示了该酶结合多种底物的潜力。
研究背景
转糖基化是碳水化合物活性酶（CAZymes）在稀水相条件下催化糖苷键合成的反应，与其水解活性并存。糖苷水解酶（GH）因来源丰富、底物特异性宽泛且可利用简单糖基供体，比Leloir糖基转移酶更适合一锅法糖合成反应。CAZy数据库中已表征的GH中，仅少数被标注为转糖苷酶或具有转糖苷酶同源超家族SSF51445区域。大多数具有转糖基化活性的GH采用保留型机制，在糖基化和去糖基化步骤中形成两个过渡态。酶结构动态、活性位点设计、正负亚位点与底物的相互作用以及去糖基化步骤的过渡态能级，是决定GH转糖基化效率的关键因素。多种GH的转糖基化活性可合成二糖、寡糖、多糖，或糖基化非碳水化合物基团以提升其生物利用度和溶解度，如β-葡萄糖苷酶（GH1、GH3）、α-淀粉酶等。然而，针对特定反应鉴定高效转葡糖苷酶仍是主要挑战。
研究方法
2.1 微生物
产转葡糖苷酶（TG）的真菌黑曲霉BTCF 5为CSIR-NIIST培养物保藏中心的实验室分离株（GenBank登录号：PP182179.1）。大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，Komagataella phaffii-X33（Mut+）（EasySelect™ Pichia表达试剂盒，Invitrogen）用于克隆和过表达研究。
【数据】菌株：黑曲霉BTCF 5（GenBank：PP182179.1）；大肠杆菌DH5α；K. phaffii-X33（Mut+）；培养基：原文未详述
2.2 全基因组测序
使用NovaSeq6000在印度喀拉拉邦科钦OmicsGen Life Sciences Pvt. Ltd.完成黑曲霉BTCF 5的基因组DNA分离和下一代测序。双端测序后使用FASTQC工具进行reads质量评估。使用定制Perl脚本修剪低质量碱基以保留高质量序列用于后续分析，并使用Cutadapt（版本3.7）[25]从reads中去除接头序列。预处理后的reads与从NCBI下载的参考菌株黑曲霉ITEM 5010比对。使用BWA程序（版本0.7.17-r1188）[26]以默认参数进行比对。使用Samtools（版本1.17）[27]进行SNP检测。使用定制Perl脚本基于比对质量和深度过滤变异。
【数据】测序平台：NovaSeq6000；工具：FASTQC、Cutadapt v3.7、BWA v0.7.17-r1188、Samtools v1.17；参考菌株：黑曲霉ITEM 5010；参数：默认参数
2.3 克隆用转葡糖苷酶的选择
黑曲霉BTCF 5分泌的转葡糖苷酶经纯化鉴定为GH31 CAZyme，其肽段与黑曲霉（菌株ITEM 5010）中注释为 probable α/β glucosidase agdC 的蛋白匹配（UniProt登录号A0A1R3RLA3），此结果来自我们前期工作[28]。对应A0A1R3RLA3的蛋白序列GenBank登录号为OOF95272.1，对应黑曲霉（菌株ITEM 5010）染色体KV907500.1中的基因ID 242_ASPCADRAFT_207758。鉴定了黑曲霉BTCF 5中目的基因的注释变异序列。通过Expasy translate工具获得氨基酸序列，并在SignalP中分析以鉴定信号肽区域[29]。
【数据】蛋白：GH31 CAZyme；UniProt：A0A1R3RLA3；GenBank：OOF95272.1；基因ID：242_ASPCADRAFT_207758；染色体：KV907500.1；工具：Expasy translate、SignalP
2.4 转葡糖苷酶的克隆与过表达
#### 2.4.1 cDNA合成
培养物在改良Mandels和Weber培养基[30]中生长。使用含1 × 10⁷孢子/mL的预接种物（由5天龄PDA斜面制备，以1%葡萄糖为碳源）接种培养基，在30 ± 2 °C、200 rpm振荡条件下培养48 h。过滤菌丝体，称重，转移至含1% w/v羧甲基纤维素（CMC）作为碳源的培养基中，在30 ± 2 °C、200 rpm条件下培养72 h。培养基组成（g/L）：KH₂PO₄（4.0）、CaCl₂（3.0）、尿素（1.0）、MgSO₄·7H₂O（9.0）、硫酸铵（14.0）、酵母提取物（2.0）、蛋白胨（0.5）、Tween-80（0.5）、FeSO₄·7H₂O（0.005）、CoCl₂（0.01）和ZnSO₄·7H₂O（0.01）。过滤菌丝体并用无菌超纯水洗涤以避免培养基成分残留。在无菌条件下称取1.0 g菌丝体，立即用液氮研磨，随后使用PureLink™ RNA Mini Kit（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）提取RNA。使用NanoDrop™ ND-1000 UV-Vis分光光度计检查RNA浓度和质量，通过琼脂糖凝胶电泳分析完整性。进行DNase（1 μg）处理以去除基因组DNA，使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒按制造商方案合成cDNA。
【数据】孢子浓度：1 × 10⁷孢子/mL；PDA斜面：5天龄，1%葡萄糖；培养条件：30 ± 2 °C，200 rpm，48 h（预培养）/72 h（CMC诱导）；CMC：1% w/v；培养基组分（g/L）：KH₂PO₄ 4.0、CaCl₂ 3.0、尿素1.0、MgSO₄·7H₂O 9.0、硫酸铵14.0、酵母提取物2.0、蛋白胨0.5、Tween-80 0.5、FeSO₄·7H₂O 0.005、CoCl₂ 0.01、ZnSO₄·7H₂O 0.01；菌丝体：1.0 g；DNase：1 μg；试剂盒：PureLink™ RNA Mini Kit、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
#### 2.4.2 通过Gibson组装构建重组质粒
从cDNA扩增插入基因。设计正向引物时，去除了对应天然信号肽区域的初始51个碱基（编码16个氨基酸）。在反向引物中去除终止密码子，使基因与载体中的6× His标签和终止密码子保持阅读框一致。引物按GeneArt™ Gibson Assembly® HiFi Cloning Kit手册设计，引物具有20–40 nt序列，5′端与载体同源，18–25 nt对应插入序列。插入片段合成所用引物为正向引物5’-AGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATTGGATCCCGAGGAAGC-3′（58 nt）和反向引物5’-CATGTCTAAGGCTACAAACTCAATGATGATGATGATGATGTTTCAACTTGACTTCCTTAGATC-3′（63 nt）。重组质粒构建设计为与α-因子信号序列同框且位于其下游，以使过表达蛋白分泌至胞外组分。使用EasySelect™ Pichia Expression Kit（Invitrogen）进行克隆和过表达研究。载体pPICZαB（3597 bp）含有天然酿酒酵母α-因子分泌信号和Zeocin抗性基因，用于大肠杆菌和K. phaffii中的筛选。使用GeneArt™ Gibson Assembly® HiFi Cloning Kit通过Gibson组装构建重组质粒。使用Q5® High Fidelity 2× Master Mix通过PCR线性化载体，正向引物5’-CATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGC-3’，反向引物5’-AGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAG-3’，删除编码c-myc表位区域和多克隆位点的碱基，使插入序列位于编码多聚组氨酸（6× His）标签和终止密码子的载体区域上游。Gibson组装使用1×浓度GeneArt™ Gibson Assembly® HiFi Master Mix，载体与插入DNA以1:1比例、浓度0.08 pmols，在50 °C反应1 h。反应混合物体积为20 μl。工作流程（图S1）和Gibson Assembly引物设计使用SnapGene软件完成。产物通过琼脂糖凝胶电泳确认。
【数据】正向引物：58 nt；反向引物：63 nt；载体：pPICZαB（3597 bp）；插入基因：2639 bp；重组质粒：6040 bp；Gibson组装：1× Master Mix，载体:插入=1:1，0.08 pmols，50 °C，1 h；反应体积：20 μl；信号肽去除：初始51个碱基（16个氨基酸）
#### 2.4.3 在Komagataella phaffii X-33中克隆
取1 μl Gibson组装反应混合物转化感受态大肠杆菌DH5α，在含Zeocin（25 μg/mL）的低盐LB平板上生长。将单个转化菌落转移至含Zeocin（25 μg/mL）的低盐LB肉汤中，在37 °C、200 rpm过夜培养以扩增质粒。使用GeneJet Plasmid Miniprep Kit（Thermo Scientific）分离重组质粒。使用5′和3′ AOX1测序引物（EasySelect™ Pichia Expression Kit，Invitrogen）对重组质粒进行PCR，并使用MssI线性化以确认插入片段的存在。重组质粒的酶切和毕赤酵母转化按EasySelect™ Pichia Expression手册推荐进行。使用FastDigest MssI（Thermo Scientific）线性化10 μg重组质粒，并使用GeneJet PCR Purification kit（Thermo Scientific）纯化。取约3 μg线性化重组质粒转化Komagataella phaffii-X33，转化子在含Zeocin（100 μg/mL）的YPD-山梨醇平板上筛选。随机选取十个转化菌落筛选酶的表达。菌落在YPD琼脂平板上生长，挑取单菌落接种至10 mL YPD培养基中，在30 °C、250 rpm过夜培养。将初级接种物转移至10 mL含甘油的缓冲复合培养基（BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mM磷酸钾缓冲液-pH 6，1.34%酵母氮源，4 × 10⁻⁵%生物素，1%甘油）中至终OD₆₀₀为0.1 [31]，在相同条件下培养至OD₆₀₀在2至6之间。细胞在3000 ×g离心5 min，重悬于50 mL含甲醇的缓冲复合培养基（BMMY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mM磷酸钾缓冲液-pH 6，1.34%酵母氮源，4 × 10⁻⁵%生物素，0.5%甲醇）中诱导表达。
【数据】Zeocin浓度：25 μg/mL（大肠杆菌）、100 μg/mL（酵母）；重组质粒用量：10 μg（线性化）、3 μg（转化）；MssI：FastDigest；YPD-山梨醇平板：含Zeocin 100 μg/mL；BMGY：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6、1.34%酵母氮源、4 × 10⁻⁵%生物素、1%甘油；BMMY：1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6、1.34%酵母氮源、4 × 10⁻⁵%生物素、0.5%甲醇；培养条件：30 °C，250 rpm；离心：3000 ×g，5 min
研究结果
3.1 黑曲霉BTCF 5的全基因组测序
预处理后的reads使用BWA比对器与参考菌株黑曲霉ITEM 5010比对。原始reads已提交至NCBI，BioProject登录号PRJNA1101449。样品中超过92%的总预处理reads比对到参考基因组。Read比对摘要见表1。
【数据】比对率：>92%；BioProject：PRJNA1101449；参考菌株：黑曲霉ITEM 5010；比对工具：BWA
3.2 黑曲霉BTCF 5转葡糖苷酶的表征
前期研究[28]中鉴定的转葡糖苷酶对应GH31 CAZyme，其肽段与UniProt登录号A0A1R3RLA3下注释为 probable α/β glucosidase 的蛋白匹配。GenBank登录号OOF95272.1的蛋白在参考菌株黑曲霉（菌株ITEM 5010）染色体KV907500.1中由基因ID 242_ASPCADRAFT_207758表示。鉴定了黑曲霉BTCF 5中编码该蛋白的基因注释变异序列，编码区含有24个单核苷酸多态性（SNP）。该基因被选用于后续克隆和过表达研究。蛋白序列确定为869个氨基酸，为分泌蛋白，信号肽跨越1–16位氨基酸。
【数据】SNP数：24个（编码区）；氨基酸数：869；信号肽：1–16位氨基酸；UniProt：A0A1R3RLA3；GenBank：OOF95272.1；基因ID：242_ASPCADRAFT_207758；染色体：KV907500.1
#### 3.2.1 转葡糖苷酶的克隆与过表达
载体pPICZαB被线性化（3481 bp）（图1a）。插入基因从cDNA扩增，带有载体悬垂（2639 bp）（图1b）。Gibson组装产生大小为6040 bp的重组质粒，转化至大肠杆菌DH5α。使用结合于插入DNA两侧AOX1启动子和终止子区域的5′和3′ AOX1测序引物进行PCR，产物大小为3010 bp（图1c）。重组质粒的线性化确认了插入片段的存在（6040 bp）（图1d）。插入片段的核苷酸序列经测序确认，提交至GenBank，登录号PP747376，蛋白ID XAJ03388。使用线性化质粒转化K. phaffii。筛选十个转化菌落用于TG表达。蛋白浓度在培养96 h后达到最大值0.12 mg/mL，但在48 h培养滤液中观察到更高的转糖基化活性。所有克隆均在胞外组分中产生TG，最大Ty达10.2 ± 0.05 g/L（图2、图3b）。仅含宿主K. phaffii的胞外培养组分作为阴性对照未检测到Ty（图3c）。His标签纯化的G4TG的SDS-PAGE分析显示，在55 kDa附近有一条粗的单一条带，在100至70 kDa之间有一条宽化条带，在250至130 kDa之间有一条单一条带（图4），而根据氨基酸序列预测的分子量为95 kDa。SDS-PAGE中观察到的多条带表明该蛋白为异源二聚体，类似于来自不同曲霉属物种（如A. niger、A. nidulans和A. sojae）的已报道GH31 α-葡萄糖苷酶[20,21]。每个凝胶条带的LC-MS/MS分析排除了其他蛋白的可能性，因为获得的肽段与单一蛋白匹配，UniProt登录号A0A1R3RLA3（probable α/β glucosidase），与我们前期研究报道一致（表S1）。因此，所有条带均确认为纯化的转葡糖苷酶，具有与其他曲霉GH31蛋白相似的结构特征。在K. phaffii异源表达过程中，许多蛋白观察到广泛糖基化[46,47]，这可能是条带宽化的原因。其以异源二聚体形式存在的原因在晶体学研究揭示A. sojae表达的GH31 α-葡萄糖苷酶结构（PDB ID-7XOI）[47]之前尚不清楚。该研究确定天然蛋白的翻译后蛋白水解加工是加工、形成和打开催化位点以接触底物的关键因素。一段100个残基的序列，被报道为NC（非保守）序列，在7XOI的晶体学数据中缺失，被鉴定为通过该蛋白水解加工去除，导致蛋白形成异源二聚体。这可能也是纯化重组TG的SDS-PAGE中观察到多条带的可能原因。除了70和55 kDa附近的蛋白条带外，130 kDa附近的条带可能代表胞外组分中剩余未被蛋白水解切割的蛋白。该来自曲霉属的GH31 α-葡萄糖苷酶/转葡糖苷酶的结构似乎不同于细菌GH31 α-葡萄糖苷酶的多聚体和二聚体结构，后者每条多肽链具有多个催化位点[48]。翻译后蛋白水解加工可能是该酶异源二聚体存在的原因，该加工是催化位点加工和打开的关键因素。TG XAJ03388的结构细节和蛋白水解加工位点的详细见解可通过X射线晶体学研究获得。
【数据】载体线性化：3481 bp；插入基因：2639 bp；重组质粒：6040 bp；AOX1 PCR产物：3010 bp；GenBank：PP747376；蛋白ID：XAJ03388；最大蛋白浓度：0.12 mg/mL（96 h）；最大Ty：10.2 ± 0.05 g/L；预测分子量：95 kDa；SDS-PAGE条带：~55 kDa、100–70 kDa、250–130 kDa；LC-MS/MS：UniProt A0A1R3RLA3；PDB：7XOI；NC序列：100个残基
3.3 重组转葡糖苷酶的催化活性
#### 3.3.1 α-和β-葡萄糖苷酶活性
转葡糖苷酶被注释为 probable α/β glucosidase。因此，使用麦芽糖和纤维二糖作为底物测定α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性。TG显示α-葡萄糖苷酶活性为14.03 ± 0.44 IU/mL。相比之下，未检测到β-葡萄糖苷酶活性，表明TG没有真正的纤维二糖酶活性，可称为α-葡萄糖苷酶/转葡糖苷酶。
【数据】α-葡萄糖苷酶活性：14.03 ± 0.44 IU/mL；β-葡萄糖苷酶活性：未检测到；底物：麦芽糖、纤维二糖
#### 3.3.2 转糖基化活性
GH催化的转糖基化反应通常弱于其水解反应，导致产量较低和孵育时间较长。大多数研究的GH31 α-葡萄糖苷酶用于合成碳水化合物，主要是异麦芽寡糖（IMO）[49]，更高的产物产量总是需要更长的孵育时间。本研究监测了转糖基化反应对非碳水化合物分子——抗坏血酸糖基化生成AA2G。然而，重组GH31 α-葡萄糖苷酶/转葡糖苷酶（TG）随着蛋白浓度增加，在缩短的孵育时间内显示出增加的转糖基化产量，这与使用天然粗酶时的观察结果相反，后者在我们前期研究中需要24 h孵育时间才能获得最大转糖基化产物产量[28]。使用0.1 mg/mL蛋白浓度的重组TG进行转糖基化测定的孵育时间优化研究表明，孵育时间从24 h显著缩短至10 h，同时保持相似的Ty为10.80 ± 0.28 g/L AA2G，略高于24 h孵育所得（10.2 ± 0.05 g/L）。这一观察至关重要，因为这表明重组转葡糖苷酶与其他用于转糖基化研究和AA2G合成的CAZymes相比，是一种快速起效且独特的转葡糖苷酶。因此，研究使用增加至2 mg/mL的蛋白浓度（生产重组TG时获得的最大蛋白浓度）并相应缩短孵育时间。使用0.3 mg/mL蛋白浓度，孵育时间进一步缩短至5 h，Ty为10.84 ± 0.35 g/L AA2G（图5a）。当使用1 mg/mL和2 mg/mL蛋白浓度时，Ty在1 h内分别达到10.93 ± 0.46 g/L和12.84 ± 0.26 g/L。有趣的是，将反应时间缩短至30 min，使用2 mg/mL蛋白浓度时Ty进一步增加至13.03 ± 0.40 g/L（116 mM AA2G，21% AA和8%麦芽糖转化率）（图5b）。这也可产生更高的AA2G生产率26 g/L/h，与其他重组酶相比为迄今报道的最高生产率。
【数据】蛋白浓度：0.1 mg/mL → Ty 10.80 ± 0.28 g/L（10 h）；0.3 mg/mL → Ty 10.84 ± 0.35 g/L（5 h）；1 mg/mL → Ty 10.93 ± 0.46 g/L（1 h）；2 mg/mL → Ty 12.84 ± 0.26 g/L（1 h）；2 mg/mL → Ty 13.03 ± 0.40 g/L（30 min）；AA2G：116 mM；AA转化率：21%；麦芽糖转化率：8%；生产率：26 g/L/h；对照24 h：10.2 ± 0.05 g/L
3.4 重组转葡糖苷酶的计算机模拟分析
InterPro扫描结果（图6）显示该蛋白属于GH31家族，具有(α/α)₆桶状结构域。系统发育树（图7）显示重组TG-XAJ03388与来自A. sojae、A. niger和A. nidulans的GH31 α-葡萄糖苷酶聚类在一起。多序列比对（图8）显示了GH31蛋白中保守残基的分布。通过比较建模构建的转葡糖苷酶（G4TG）结构（图9）以A. sojae GH31 α-葡萄糖苷酶（PDB ID-7XOI）为模板。分子对接和亚位点鉴定（图10）基于麦芽糖和抗坏血酸的结合确定了亚位点，并展示了TG与麦芽糖和抗坏血酸对接的2D和3D图示。
【数据】家族：GH31；结构域：(α/α)₆桶状；模板：PDB 7XOI（A. sojae GH31 α-葡萄糖苷酶）；系统发育：与A. sojae、A. niger、A. nidulans GH31聚类；对接底物：麦芽糖、抗坏血酸
讨论与解读
GHs是合成糖化学中有吸引力的候选者。黑曲霉BTCF 5产生的GH31 TG在K. phaffii中异源表达，被鉴定为一种快速起效的转葡糖苷酶，可将AA糖基化生成AA2G，Ty为13 g/L AA2G，生产率为26 g/L/h AA2G，为迄今报道的最高值。对接研究确定了转葡糖苷酶的亚位点及其结合不同底物的能力，表明该转葡糖苷酶可能对除麦芽糖和抗坏血酸外的多种配体具有糖基化潜力。详细的结构表征研究和通过计算机辅助及基因工程策略进行的酶修饰研究，可帮助我们开发用于高级糖合成反应的潜在转葡糖苷酶。
编译者解读：本研究最突出的价值在于"快"——30分钟、13 g/L、26 g/L/h，这组数据在GH31转糖基化领域确实少见。选择GH31家族而非更常见的GH13或GH70，说明作者看重的是该酶对抗坏血酸这类非碳水化合物受体的宽泛底物容忍度。但也要看到局限：异源二聚体的翻译后加工机制尚未通过晶体学直接证实，蛋白浓度需高至2 mg/mL才能达到最高产量，工业成本是否可接受仍是问号。对接结果预测了多底物潜力，但缺乏实验验证。总体而言，这是一个有工业转化前景的候选酶，但距离规模化应用还有酶工程改造的空间。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2026
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154421
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154421