来源：Efficient expression of full-length triple-helix recombinant type III collagen in Pichia pastoris（Synthetic and Systems Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
III型胶原蛋白（COL3A1）在血管与皮肤组织中含量丰富，是伤口愈合与组织修复的关键结构蛋白。本研究在毕赤酵母中建立了全长人COL3A1的分泌表达平台，系统比较了脯氨酰4-羟化酶（P4H）共表达与T4-纤维蛋白C端三聚化结构域融合两种促进三螺旋形成的策略。结构分析表明，T4-纤维蛋白融合策略在驱动三螺旋形成与后续纤维自组装方面显著优于P4H共表达。功能上，融合蛋白表现出最佳的促间充质干细胞增殖、迁移及促凝血活性。经信号肽与启动子筛选及发酵参数优化，250 mL摇瓶产量达0.22 g/L，5 L生物反应器产量达0.9 g/L。
研究背景
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的结构蛋白，广泛存在于皮肤、骨骼、肌腱、软骨和血管等组织中。它通过蛋白质聚合形成的精细结构发挥多种功能，在细胞、组织和器官的生理活动中扮演关键角色。目前已鉴定出至少28种不同类型的胶原蛋白。随着生物医药、化妆品和保健食品等行业对胶原蛋白需求的增长，依赖动物提取的传统生产方法因成本高、效率低而难以满足日益扩大的需求。此外，动物源胶原蛋白可能引发免疫排斥、病原体传播，并受到文化或宗教方面的限制。
为应对这些挑战，重组表达技术已被开发并广泛应用于胶原蛋白生产，主要利用动物细胞系统、原核微生物系统和真核微生物系统。然而，原核表达系统在蛋白质折叠修饰方面能力有限，且存在内毒素问题和高纯化成本。相比之下，真核宿主拥有更完善的蛋白质折叠和翻译后修饰系统，是复杂蛋白表达的优选宿主。在真核宿主中，酵母系统尤其受到关注。
研究方法
2.1 质粒构建
从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索获得全长人COL3A1、人脯氨酰4-羟化酶α和β亚基（hP4H）、微球菌病毒脯氨酰4-羟化酶（jP4H）以及T4-纤维蛋白C端三聚化结构域的氨基酸序列。所有序列均针对毕赤酵母表达进行了密码子优化。将全长COL3A1和去除末端前肽的COL3A1基因序列分别克隆到pPIC9K质粒中。将hP4H和jP4H基因克隆到pPICZα质粒中。对于T4-纤维蛋白融合，将T4-纤维蛋白C端结构域插入到去除前肽的COL3A1序列的C端（图3b）。所有构建体均通过测序验证。
【数据】质粒：pPIC9K、pPICZα；基因：COL3A1、hP4H、jP4H、T4-fibritin C端结构域；验证方法：测序；序列来源：NCBI数据库
2.2 重组表达
所有重组质粒在大肠杆菌JM109菌株中扩增。对于蛋白表达，使用限制性内切酶SalI将重组质粒线性化，并通过电穿孔整合到毕赤酵母GS115基因组中。转化子在MD平板（20 g/L葡萄糖、13.4 g/L无氨基酸酵母氮源、0.4 mg/L生物素和20 g/L琼脂）上于30 °C培养2–3天后进行筛选。随后，将菌株接种到YPD液体培养基（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖）中生长。在含1%甲醇的BMMY培养基（20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、3 g/L K₂HPO₄、11.8 g/L KH₂PO₄、1 mL/L纯甘油、13.4 g/L无氨基酸酵母氮源和0.4 mg/L生物素）中于30 °C诱导蛋白表达。发酵后，通过离心收集培养上清液，并用10% SDS-PAGE进行分析。每孔上样10 μL样品，与蛋白质分子量标准品同时电泳，凝胶用考马斯亮蓝R250染色，并使用凝胶成像系统（Bio-Rad，加利福尼亚，美国）成像。使用ImageJ软件相对于标准品对重组胶原蛋白条带进行定量。对于Western blotting分析，将蛋白质在300 mA下转移至PVDF膜150分钟，并与抗his抗体（Biotime Biotechnology Co.，中国）孵育。
【数据】菌株：大肠杆菌JM109、毕赤酵母GS115；线性化酶：SalI；MD平板：20 g/L葡萄糖、13.4 g/L无氨基酸酵母氮源、0.4 mg/L生物素、20 g/L琼脂；MD培养温度：30 °C；MD培养时间：2–3天；YPD培养基：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖；BMMY培养基：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、3 g/L K₂HPO₄、11.8 g/L KH₂PO₄、1 mL/L纯甘油、13.4 g/L无氨基酸酵母氮源、0.4 mg/L生物素；甲醇浓度：1%；诱导温度：30 °C；SDS-PAGE浓度：10%；上样量：10 μL/孔；Western blot转移条件：300 mA、150 min；抗体：抗his抗体
2.3 CD光谱
对于CD光谱分析，将样品在pH 7.5的磷酸缓冲液（PB）中稀释至0.2 mg/mL，并在4 °C预孵育12小时。使用配备Peltier温度控制器（型号110-OS；Hellma GmbH & Co. KG，Müllheim，德国）的Chirascan CD光谱仪（Applied Photophysics Ltd.，Leatherhead，英国）和石英比色皿（型号110-OS；光程1 mm；Hellma GmbH & Co. KG）获取CD光谱。光谱在190–250 nm波长范围内获取。熔解温度（Tm）由加热过程中（10–80 °C，1 °C/min）220 nm处椭圆率变化得到的标准曲线计算。
【数据】样品浓度：0.2 mg/mL；缓冲液：PB、pH 7.5；预孵育：4 °C、12 h；波长范围：190–250 nm；加热范围：10–80 °C；加热速率：1 °C/min；检测波长：220 nm；光程：1 mm
2.4 SEM和TEM
对于TEM分析，将样品在超纯水中稀释至1 mg/mL，并在4 °C孵育3天。然后将样品溶液吸附到铜网上1分钟，之后用滤纸去除多余溶剂。在用透射电子显微镜成像之前，样品用0.75%磷钨酸（型号H-7650；Hitachi High-Tech，东京，日本）负染。对于SEM分析，样品制备浓度为3 mg/mL，在4 °C孵育直至形成水凝胶。随后，将样品冻干并使用扫描电子显微镜（型号SU8220；Hitachi High-Tech）进行分析。
【数据】TEM样品浓度：1 mg/mL；TEM孵育：4 °C、3天；铜网吸附时间：1 min；负染液：0.75%磷钨酸；TEM型号：H-7650；SEM样品浓度：3 mg/mL；SEM孵育：4 °C至水凝胶形成；SEM型号：SU8220
2.5 细胞活力检测
牛间充质干细胞（MSCs）在补充有1%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）和1%抗生素-抗真菌剂（Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco）中，于标准培养条件（37 °C，5% CO₂）下维持培养。细胞在达到80–90%汇合度时进行传代。对于增殖检测，将细胞以1.5 × 10³个/孔的密度接种于96孔板中，孵育24小时。然后将培养基替换为含有100 mg/L测试蛋白的新鲜培养基或空白培养基（阴性对照）。再过24小时后，向每孔加入10 μL CCK-8试剂。孵育3小时后，使用酶标仪（BioTek，Winooski，VT，美国）在450 nm处测量吸光度。
【数据】细胞类型：牛间充质干细胞；培养基：DMEM + 1% FBS + 1%抗生素-抗真菌剂；培养条件：37 °C、5% CO₂；传代汇合度：80–90%；接种密度：1.5 × 10³个/孔；预孵育时间：24 h；蛋白浓度：100 mg/L；CCK-8加入量：10 μL/孔；CCK-8孵育时间：3 h；检测波长：450 nm
2.6 细胞迁移检测
使用划痕愈合实验评估细胞迁移。将牛间充质干细胞（MSCs）以5 × 10⁵个/孔的密度接种于12孔板中，生长至约95%汇合度。使用无菌移液枪头在单层细胞中划出均匀划痕。然后洗涤细胞，并在补充有100 mg/L相应蛋白样品或仅含培养基（对照）的低血清培养基（含1% FBS、1%抗生素-抗真菌剂的DMEM）中孵育。24小时后，在相差显微镜下观察伤口闭合情况，并通过使用ImageJ软件测量剩余划痕面积来量化迁移率。
【数据】细胞类型：牛间充质干细胞；接种密度：5 × 10⁵个/孔；培养板：12孔板；汇合度：约95%；蛋白浓度：100 mg/L；低血清培养基：DMEM + 1% FBS + 1%抗生素-抗真菌剂；孵育时间：24 h；分析软件：ImageJ
2.7 凝血检测
使用乏血小板血浆进行体外血液凝固检测。血液以1500 g离心5分钟。然后使用血细胞计数板对上清液中的细胞进行计数。随后收集上清液并补充2 mg/mL冻干COL3A1。在25 °C孵育30分钟后，将上清液以1500 g离心20分钟。最后，再次使用血细胞计数板对上清液中的细胞进行计数，并计算细胞的凝固率。
【数据】离心条件：1500 g、5 min；COL3A1浓度：2 mg/mL；孵育温度：25 °C；孵育时间：30 min；二次离心：1500 g、20 min；检测方法：血细胞计数板计数
2.8 启动子和信号肽的工程改造
鉴于启动子在异源蛋白表达中的关键作用，我们将pPIC9K质粒中的AOX1启动子替换为其他甲醇诱导型启动子。这些包括AOX1M（AOX1的突变体）、AOX2M（AOX2的突变体）、TEF、CAT1、CAT1M（CAT1的突变体）、DAS1、DAS2、ADH2和ADH2M（ADH2的突变体）。此外，我们探索了使用信号肽来提高分泌效率。建立了信号肽文库，包括α-factor、Msb2、OST1-α、PIR1、SP-0030、DAN4、α-MF、Fre2、GAS1和PHO1。相关信号肽序列见表S1。
【数据】启动子：AOX1M、AOX2M、TEF、CAT1、CAT1M、DAS1、DAS2、ADH2、ADH2M；信号肽：α-factor、Msb2、OST1-α、PIR1、SP-0030、DAN4、α-MF、Fre2、GAS1、PHO1；质粒：pPIC9K
2.9 5L高密度发酵
完整的补料分批发酵在5 L生物反应器（T&J Bio-Engineering，上海，中国）中进行。改良的基础盐培养基（BSM）通过将标准配方稀释至其原始浓度的一半并补充20 g/L蛋白胨来制备。生物反应器接种10%（v/v）种子培养物。过程中，温度维持在30 °C，pH使用50%（v/v）氨水溶液控制在5.5。当溶解氧（DO）水平恢复至55%时，以6 mL/L/h的恒定速率引入含有50%（v/v）甘油和1.2%（v/v）PTM1微量盐的补料溶液。甘油补料持续时间可变，在此期间pH调节至5.5，温度保持30 °C，同时继续补充碳源。整个发酵过程中，通过控制搅拌和通气将溶解氧维持在20%–30%之间。
【数据】生物反应器：5 L；培养基：1/2 BSM + 20 g/L蛋白胨；接种量：10%（v/v）；温度：30 °C；pH：5.5（50%氨水调节）；DO恢复阈值：55%；补料速率：6 mL/L/h；补料液：50%（v/v）甘油 + 1.2%（v/v）PTM1；DO维持范围：20%–30%
2.10 统计分析
数据使用GraphPad Prism 10.0软件分析。结果以平均值 ± 标准差表示。组间统计学显著性使用t检验和单因素方差分析（ANOVA）评估。显著性水平表示如下：∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.001，∗∗∗∗P < 0.0001。
【数据】分析软件：GraphPad Prism 10.0；数据表示：mean ± SD；统计方法：t检验、单因素ANOVA；显著性水平：∗P < 0.05、∗∗P < 0.01、∗∗∗P < 0.001、∗∗∗∗P < 0.0001
研究结果
3.1 全长人COL3A1在毕赤酵母中的重组表达
由于胶原蛋白的N端和C端前肽可能影响蛋白表达[33]，构建了含和不含末端肽的两种质粒（图2a–b）。相应的菌株aCOL3A1（含末端前肽）和aSCOL3A1（不含末端前肽）在摇瓶中培养72小时。通过SDS-PAGE分析培养上清液显示，aCOL3A1菌株未产生可检测的目标蛋白（图2c）。相比之下，在aSCOL3A1菌株的培养上清液中观察到130 kDa和100 kDa两条明显条带，表明全长COL3A1成功表达（图2d）。这些结果表明，去除末端前肽对于全长COL3A1在毕赤酵母中的成功表达至关重要，支持了胶原蛋白末端前肽序列可能抑制毕赤酵母分泌系统功能的假设[31,34,35]。此外，对aSCOL3A1菌株产生的两条条带进行了MALDI-TOF MS和Western blot分析，确认两条条带均对应目标蛋白（图2f–h）。aSCOL3A1的理论分子量为99.06 kDa。观察到的分子量上移可能是由于全长COL3A1中高脯氨酸含量所致。脯氨酸有助于形成刚性结构，阻碍完全变性和均匀的SDS结合[36]。结果，电荷质量比降低，从而减缓了蛋白在SDS-PAGE中的迁移。对电泳凝胶进行成像分析后，使用ImageJ软件评估并定量了130 kDa处目标蛋白的胞外分泌水平。结果表明，aSCOL3A1的表达随时间逐渐增加然后下降，在60小时达到最大值57.43 mg/L（图2e）。
【数据】菌株：aCOL3A1、aSCOL3A1；培养时间：72 h；目标条带分子量：130 kDa、100 kDa；理论分子量：99.06 kDa；最大表达量：57.43 mg/L；达峰时间：60 h；鉴定方法：MALDI-TOF MS、Western blot；定量软件：ImageJ
3.2 重组全长COL3A1的结构优化
为促进重组全长COL3A1三螺旋结构的形成，采用了两种独立策略。第一，分别构建了编码人P4H（hP4H）和微球菌病毒P4H（jP4H）的质粒（图3a），并整合到aSCOL3A1菌株中，生成相应的菌株aSCOL3A1-hP4H和aSCOL3A1-jP4H。第二，将T4-纤维蛋白的C端三聚化结构域融合到aSCOL3A1的C端，得到aSCOL3A1T菌株（图3b）。培养上清液的SDS-PAGE分析显示，P4H共表达和T4-纤维蛋白融合均未显著影响全长COL3A1的产量（图3c）。此外，通过CD光谱评估了所得蛋白的二级结构。在aSCOL3A1、aSCOL3A1-hP4H和aSCOL3A1-jP4H菌株样品的CD光谱中未观察到220–222 nm处的特征性正峰。相比之下，aSCOL3A1T来源的样品不仅表现出220–222 nm处独特的正峰，而且在198 nm附近表现出显著增强的负峰（图3d），表明存在聚脯氨酸II型螺旋构象。为进一步评估三螺旋稳定性，进行了热变性实验。aSCOL3A1T样品的熔解温度（Tm）测定为46.6 °C，显著高于aSCOL3A1（27.5 °C）、aSCOL3A1-hP4H（29.1 °C）、aSCOL3A1-jP4H（31.0 °C）和aSCOL3A1T（46.6 °C）菌株样品的Tm值（图3e）。总体而言，这些结果表明aSCOL3A1T菌株产生的COL3A1具有更高含量的三螺旋结构和更高的稳定性[19]，意味着T4-纤维蛋白融合策略在促进全长COL3A1稳定三螺旋结构形成方面比P4H共表达更有效。通过TEM和SEM进一步分析了上述样品的高级组装。TEM显示仅在aSCOL3A1T菌株的蛋白样品中存在明确的纳米纤维，而在aSCOL3A1或P4H共表达菌株的样品中未观察到此类纤维结构（图3f）。冻干蛋白样品的SEM分析揭示了明显的形态差异（图3g）。aSCOL3A1样品表现出柔软的纤维状结构。相比之下，P4H共表达菌株的蛋白样品显示出层状多孔形态。值得注意的是，aSCOL3A1T样品显示出均匀且密集互连的多孔网络，这归因于三螺旋COL3A1通过分子间相互作用的有序排列和堆叠[37]。在冻干过程中，胶原蛋白基质本身在冰晶升华时充当支架，从而产生这种连续的多孔结构[38]。总体而言，这些数据表明T4-纤维蛋白融合策略使全长COL3A1能够组装成稳定的三螺旋结构，并进一步自组装成有序的超分子纤维。
【数据】菌株：aSCOL3A1、aSCOL3A1-hP4H、aSCOL3A1-jP4H、aSCOL3A1T；CD特征峰：220–222 nm正峰、198 nm负峰；Tm值：aSCOL3A1为27.5 °C、aSCOL3A1-hP4H为29.1 °C、aSCOL3A1-jP4H为31.0 °C、aSCOL3A1T为46.6 °C；TEM样品浓度：1 mg/mL；SEM样品浓度：3 mg/mL；检测方法：CD光谱、TEM、SEM
3.3 重组全长COL3A1的生物学活性分析
为评估重组全长COL3A1的生物学活性，我们首先评估了上述蛋白样品对MSCs增殖的影响。接种细胞后用每种重组COL3A1蛋白样品以100 mg/L处理36小时，然后通过CCK8检测测量细胞活性。与未处理对照相比，所有COL3A1样品均显著促进细胞增殖（图4a）。值得注意的是，aSCOL3A1T样品表现出最强的促增殖效果，细胞活力达到对照的2.5倍（图4b）。接下来，我们使用划痕愈合实验检测了这些蛋白样品对细胞迁移的影响。正如预期，所有全长COL3A1样品均不同程度地刺激了细胞迁移。与增殖结果一致，aSCOL3A1T样品表现出最显著的促迁移活性，迁移率约为对照的4倍（图4c–d）。已有充分文献表明，COL3A1通过结合血小板受体激活内源性止血机制来促进血液凝固[39]。因此，我们通过将小鼠血液与不同重组COL3A1样品孵育来进行体外凝血实验。由aSCOL3A1、aSCOL3A1-hP4H、aSCOL3A1-jP4H和aSCOL3A1T菌株产生的重组COL3A1诱导的凝血率分别为11.2%、17.4%、20.7%和36.9%，表明aSCOL3A1T样品具有优越的促凝血活性（图4e–f）。aSCOL3A1T蛋白显著增强的促增殖、促迁移和促凝血活性可能归因于其稳定的三螺旋结构。已知天然胶原蛋白三螺旋能赋予与特定细胞表面受体的高亲和力结合[40,41]，进而激活调节细胞增殖和迁移的下游信号通路[42]。此外，这种稳定结构使蛋白质能够进行层级自组装形成纳米纤维网络[43]。这些网络可以缠结形成水凝胶，为血小板聚集和血凝块形成提供有效的物理支架，从而增强止血效果。总体而言，这些结果证实T4-纤维蛋白融合策略成功产生了具有增强生物活性的全功能、生物相容性全长COL3A1。
【数据】细胞类型：MSCs；蛋白浓度：100 mg/L；处理时间：36 h；CCK8检测波长：450 nm；aSCOL3A1T细胞活力：对照的2.5倍；aSCOL3A1T迁移率：对照的约4倍；凝血率：aSCOL3A1为11.2%、aSCOL3A1-hP4H为17.4%、aSCOL3A1-jP4H为20.7%、aSCOL3A1T为36.9%；划痕实验时间：24 h
3.4 重组全长COL3A1的表达系统优化
为提高aSCOL3A1T菌株的表达水平，我们首先进行了信号肽优化。除原始信号肽α factor外，我们筛选了9种信号肽，包括OST1-α、Msb2、PIR1、SP-0030、DAN4、α-MF、Fre2、GAS1和PHO1。结果显示，OST1-α信号肽产生的蛋白水平最高，为0.206 mg/L，是原始α factor信号肽的4倍（图5a）。鉴于启动子在异源蛋白表达中的关键作用……
【数据】信号肽筛选数量：9种；信号肽列表：OST1-α、Msb2、PIR1、SP-0030、DAN4、α-MF、Fre2、GAS1、PHO1；最高产量信号肽：OST1-α；产量：0.206 mg/L；较α factor提升倍数：4倍
3.5 5 L生物反应器生产全长人COL3A1
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功实现了去除N端和C端前肽后全长COL3A1的表达。在COL3A1的C端添加T4-纤维蛋白C端结构域有效促进了胶原蛋白的三螺旋折叠。已证实该COL3A1在细胞水平上表现出显著的生物学活性，表明其在皮肤护理和伤口修复中具有潜在应用。通过替换信号肽、优化启动子和改进发酵条件进一步提高了产量。使用5 L发酵罐证明了高密度发酵的可行性，为未来工业生产奠定了基础。后续研究可探究该重组胶原蛋白在动物模型中的修复效果及其在复合生物材料中的行为。总体而言，全长人COL3A1在伤口修复和组织工程中展现出相当大的前景，未来具有更广泛应用的潜力。
编译者解读：该研究在方法选择上有两点值得关注。其一，果断去除末端前肽以解除毕赤酵母分泌瓶颈，这是表达复杂胶原蛋白的务实之举。其二，T4-纤维蛋白三聚化结构域融合策略显著优于P4H共表达——Tm从27.5 °C跃升至46.6 °C，且唯一观察到纳米纤维自组装，说明在酵母中三螺旋形成的限速步骤可能并非羟化不足，而是链间正确配对与成核。该策略绕开了P4H共表达带来的氧化还原负担，为其他多聚体蛋白在酵母中的折叠优化提供了可借鉴思路。局限在于产量仍偏低（5 L罐0.9 g/L），且未验证动物模型中的修复效果，距工业化尚有距离。
参考来源
期刊：Synthetic and Systems Biotechnology, 2027
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.037
DOI: 10.1016/j.synbio.2026.04.037