来源：Enhancing the thermostability of the zearalenone lactonase ZENM through an integrated computer-aided rational design workflow（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
玉米赤霉烯酮（ZEN）内酯酶为真菌毒素脱毒提供了一条环境友好的路径，但热稳定性不足限制了其工业应用。本研究采用计算与实验相结合的工作流，对来自 Monosporascus sp. GIB2 的 ZEN 内酯酶 ZENM 进行热稳定性改造。通过 FireProt 与 PROSS 引导的设计、基于 ΔΔG 的筛选和基于结构的过滤，研究者从约 5400 个非冗余单点设计中筛选出 33 个候选替换进行实验验证。最终获得的优势变体 A59P 在保持野生型催化活性的同时，55 °C 下半衰期延长 9.8 倍，T₅₀ 提高 7.6 °C，表观熔解温度提升 23.20 °C。分子动力学模拟揭示，A59P 主要通过刚性化 57–71 位表面柔性环、抑制热诱导的结构波动来提升热稳定性。
研究背景
真菌毒素污染，尤其是玉米赤霉烯酮（ZEN）污染，持续威胁全球食品与饲料安全。ZEN 主要由禾谷镰刀菌及相关物种产生，在玉米、小麦、大麦及其副产品中频繁检出。国际癌症研究机构（IARC）将 ZEN 归为 3 类（对人类致癌性不可分类），但其广泛存在及在食品和饲料中的残留仍是安全管理的持续关切。气候变化——以变暖趋势和更频繁的极端天气为特征——预计将重塑真菌生态并改变谷物中真菌毒素污染的时空格局，为日益全球化的供应链风险控制增添不确定性。此外，更温暖潮湿的采后条件会增加干燥和储存难度；水分控制不当可能促进操作、运输和储存过程中的真菌生长和毒素产生。酶法降解因其高特异性、环境兼容性和对产品质量影响小而成为有吸引力的脱毒策略。工业应用要求酶在非生理条件下保持催化活性和结构完整性，热稳定性是关键属性。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株与质粒
玉米赤霉烯酮（ZEN）标准品购自青岛普瑞邦生物工程有限公司（中国青岛）。HPLC 级甲醇和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）购自 Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）；其他分析级试剂均为可获得的最高纯度。ZEN 储备液（1.0 mg/mL）用甲醇配制，储存于 −20 °C 备用。寡核苷酸引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。大肠杆菌 Top10 用于质粒构建，大肠杆菌 BL21(DE3) 用于重组蛋白表达。ZEN 内酯酶基因 zenM 克隆至 pET-24a(+) 载体，所得质粒转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 用于蛋白生产。
【数据】ZEN储备液浓度：1.0 mg/mL；储备液储存温度：−20 °C；宿主菌：E. coli Top10（克隆）、E. coli BL21(DE3)（表达）；载体：pET-24a(+)
2.2 ZEN 内酯酶 ZENM 的理性设计
按照 Musil 等人提出的组合稳定性设计策略，以 ZENM 的氨基酸序列作为计算机稳定性设计的输入。首先使用 FireProt 2.0（http://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprot）预测潜在的稳定化单残基替换。同时，使用 PROSS（http://pross.weizmann.ac.il）生成若干多位点设计。由于 PROSS 输出组合变体，每个设计被分解为相应的单残基替换（如 A59P、I87L、Q159K、H193R、S199T），与 FireProt 候选合并并去重。以 AlphaFold3 预测的 ZENM 三维结构作为结构模板。所有候选单点替换使用 FoldX 建模，计算折叠自由能变化（ΔΔG），产生约 5400 个非冗余单点替换。作为初始过滤条件，仅保留预测 ΔΔG < 0 kcal/mol 的替换（基于 FireProt 预测和/或 PROSS–FoldX 评估），得到 642 个潜在稳定化候选。为注释这 642 个位置的结构背景，使用 NetSurfP-3.0 服务器（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetSurfP-3.0/）预测二级结构类型和相对表面可及性（RSA）。结果汇总于补充表 S1。催化残基和明显埋藏于疏水核心的位置被排除。优先选择位于表面暴露的环/卷曲区域或部分暴露的 α-螺旋中 ΔΔG 下降较大的替换，同时考虑序列分布和实验可行性，如引物设计和质粒构建。基于这些标准，选择 33 个位置进行定点突变和实验验证。候选筛选漏斗和应用的过滤条件汇总于表 S2。通过整合 NetSurfP 注释、结构检查和多序列比对，进一步评估这些位点的二级结构背景、溶剂暴露和序列保守性。
【数据】初始单点设计数：约5400个；ΔΔG<0候选数：642个；选定验证位点数：33个；ΔΔG阈值：<0 kcal/mol
2.3 多序列比对与保守性分析
进行多序列比对（MSA）以评估所选位点的残基保守性和进化背景。从 NCBI 数据库检索 ZENM 和代表性 ZEN 降解内酯酶的氨基酸序列，使用 Clustal Omega（http://www.clustal.org/omega/）以默认参数进行比对。使用 ESPript 3.0 可视化比对结果，以便比较序列间的保守位置。为检查 A59 位点的序列变异性，使用 WebLogo 3.0（https://weblogo.threeplusone.com/）从比对序列生成序列标识图。标识图表示每个位置的氨基酸频率和信息含量（bits），用于定性评估第 59 位残基的保守性。
【数据】比对工具：Clustal Omega（默认参数）；可视化工具：ESPript 3.0；序列标识工具：WebLogo 3.0；目标位点：A59
2.4 定点突变、蛋白表达与纯化
以质粒 pET-24a-zenm 为模板进行定点突变。设计携带目标替换的重叠引物，使用高保真 DNA 聚合酶扩增 zenM 片段。所得线性 PCR 产物经凝胶纯化后，按照制造商说明使用 Gibson Assembly Master Mix 组装为环状表达质粒。组装质粒转化至大肠杆菌 Top10 进行克隆，阳性克隆通过 Sanger 测序验证。序列确认的变体质粒随后转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 进行重组蛋白表达。转化子涂布于含卡那霉素（50 μg/mL）的 LB 琼脂平板，37 °C 培养 10 h。挑取单菌落接种至 6 mL LB 培养基，37 °C、200 rpm 培养 12 h。种子培养液以 2%（v/v）接种量转接至 100 mL LB 培养基，37 °C、220 rpm 培养至 OD₆₀₀ 达到 0.6–0.8。以 0.4 mM IPTG 诱导蛋白表达，随后在 25 °C、200 rpm 过夜培养。离心收集细胞，重悬于裂解缓冲液（20 mM Tris–HCl、0.5 M NaCl、40 mM 咪唑，pH 7.5）。冰上超声裂解 20 min，裂解液离心澄清（12,000 ×g、4 °C、10 min）。上清液通过 Ni–NTA 亲和层析纯化获得 His 标签蛋白。SDS–PAGE 评估蛋白纯度，BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。
【数据】卡那霉素浓度：50 μg/mL；平板培养温度/时间：37 °C/10 h；种子培养：6 mL LB、37 °C、200 rpm、12 h；接种量：2%（v/v）；诱导OD₆₀₀：0.6–0.8；IPTG浓度：0.4 mM；诱导温度/转速：25 °C/200 rpm、过夜；裂解缓冲液：20 mM Tris–HCl、0.5 M NaCl、40 mM 咪唑、pH 7.5；超声时间：20 min；离心条件：12,000 ×g、4 °C、10 min
2.5 酶活性测定
通过 HPLC 定量 ZEN 消耗来评估 ZENM 及其变体的酶活性。除非另有说明，活性报告为表观（终点法）活性，由标准化条件下固定反应时间后 ZEN 浓度的降低计算得出。一个单位（U）定义为在测定条件（55 °C、pH 9.0、50 mM Tris–HCl）下平均每分钟转化 1 nmol ZEN 的酶量，即基于 15 min 反应期内的平均消耗速率。标准反应（500 μL）包含 50 mM Tris–HCl 缓冲液（pH 9.0，495 μL）和 ZEN 储备液（1.0 mg/mL 甲醇溶液，5 μL）。反应混合物中酶浓度调整为 2 μg/mL。ZEN 储备液引入的最终甲醇比例为 1%（v/v），在所有反应中保持一致。反应启动前，含酶缓冲液在 55 °C 预平衡 3 min。加入 ZEN 启动反应，轻轻混匀，55 °C 孵育 15 min。加入 1.0 mL 预冷甲醇终止反应，冰上放置 15 min。澄清后，上清液通过 0.22 μm 有机膜过滤器过滤，取 200 μL 滤液用于 HPLC 分析。HPLC 分析在反相 C18 柱上进行，以乙腈:水:甲醇（46:46:8，v/v/v）等度洗脱，流速 0.3 mL/min，柱温 35 °C。ZEN 通过荧光检测（Ex 274 nm，Em 440 nm），使用外标校准曲线定量。表观活性（U；nmol/min）由固定孵育时间内的 ZEN 消耗计算，在适用情况下通过蛋白量（mg）归一化转换为表观比活性。所有测定在相同条件下进行以比较变体间差异。
【数据】反应体系：500 μL（495 μL 缓冲液+5 μL ZEN储备液）；缓冲液：50 mM Tris–HCl、pH 9.0；酶浓度：2 μg/mL；甲醇终浓度：1%（v/v）；预平衡：55 °C、3 min；反应：55 °C、15 min；终止：1.0 mL预冷甲醇、冰上15 min；过滤：0.22 μm有机膜；HPLC流动相：乙腈:水:甲醇=46:46:8（v/v/v）；流速：0.3 mL/min；柱温：35 °C；荧光检测：Ex 274 nm、Em 440 nm；酶活单位定义：55 °C、pH 9.0下每分钟转化1 nmol ZEN
2.6 热稳定性测定（热挑战、半衰期、Tm、T50 和熔解温度）
#### 2.6.1 最适温度
使用 2.5 节所述的 HPLC 方法评估 ZENM 及其变体的最适温度，反应在 50 mM Tris–HCl 缓冲液（pH 9.0）中于 30、40、50、55、60、65、70 °C 进行。在每个温度下孵育 15 min 后，通过 HPLC 定量残余 ZEN，相对活性通过将各值归一化至温度系列中的最大活性（设为 100%）计算。相对活性使用相同的标准化终点法测定。
【数据】温度梯度：30、40、50、55、60、65、70 °C；缓冲液：50 mM Tris–HCl、pH 9.0；孵育时间：15 min；归一化方式：各温度系列内最大活性设为100%
研究结果
3.1 ZENM 变体的计算设计与实验筛选
如 2.2 节所述，应用结合 FireProt 和 PROSS 的集成计算机工作流来鉴定 ZENM 中潜在的稳定化替换，候选单点设计通过 FoldX 预测的折叠自由能变化（ΔΔG）进一步评估。合并去重后，获得约 5400 个非冗余单点设计。其中，642 个预测 ΔΔG < 0 kcal/mol 的替换被保留为推定稳定化候选，并使用 NetSurfP 注释二级结构背景和相对表面可及性（RSA）（表 S1）。催化残基和明显埋藏于疏水核心的位置被排除。优先选择位于溶剂暴露的环/卷曲片段或部分暴露的 α-螺旋中的候选，同时考虑序列分布和实验可行性（如引物设计和质粒构建）。基于这些标准，选择 33 个位置进行定点突变和实验验证。
从 33 个选定位置中，30 个位置的变体获得了可溶性重组蛋白，而三个变体（R179A、W213E 和 D226I）为不可溶，被排除在后续表征之外。此外，残基 G136 探索了三种替代替换（G136K、G136M 和 G136L），产生同一位置的多个变体（因此测试面板超过每位置一个变体）。所选替换的预测 ΔΔG 值汇总于图 1A。大多数测试替换被预测为稳定化（ΔΔG < 0），其中 A59P 在所选候选者中显示出最大的折叠自由能下降。其他几个替换，包括 C53V、H193R 和 S199T，也显示出相对较强的预测稳定化（约 −1.5 kcal/mol），支持其纳入实验筛选。
为提供所选位点的背景信息，ZENM 的 NetSurfP 衍生二级结构分配和 RSA 预测显示于图 1B。可溶性位置主要位于外周溶剂暴露区域，包括表面环/卷曲片段和二级结构元件的暴露末端/边缘，而非深埋于疏水核心或聚集在催化中心周围。一致地，将可溶性突变位点映射到 ZENM 结构模型上（图 1C）显示，大多数位点表面可及且远离催化三联体（S102、E126 和 H242），反映了一种保守的稳定性工程策略——靶向结构上允许的区域，同时最小化扰动活性位点几何构型和核心堆积的风险。
从进化角度看，ZENM 与代表性 ZEN 内酯酶的多序列比对（MSA）显示催化三联体（S102、E126 和 H242）及邻近核心元件高度保守，而若干表面暴露区域表现出明显的序列变异性（图 1D）。为评估第 59 位的进化耐受性，从比对同源物生成序列标识图（图 1E）。第 59 位显示出受限但非固定的氨基酸库，Pro 在同源物中富集，而 Ala 为 ZENM 特有，Arg 出现在少数序列中。这一模式表明 A/P/R 之间的替换在该位置是被耐受的，且 Pro 在同源物中与局部结构背景兼容。鉴于残基 59 位于柔性表面环（残基 57–71）内，在该位点引入 Pro 被假设可增加局部刚性，为 A59P 观察到的热稳定性提升提供了合理的结构解释。总之，来自能量预测、结构映射、表达结果和序列分析的汇聚证据支持 A59 是一个结构上允许且进化上耐受的工程位点，从而推动了后续 A59P 变体的生化表征和 MD 分析。
【数据】非冗余单点设计：约5400个；ΔΔG<0候选：642个；选定验证位点：33个；获得可溶性蛋白的位置：30个；不可溶变体：R179A、W213E、D226I；G136替代替换：G136K、G136M、G136L；A59P预测ΔΔG：所选候选中最大下降；C53V/H193R/S199T预测ΔΔG：约−1.5 kcal/mol；催化三联体：S102、E126、H242
3.2 实验筛选鉴定 A59P 为领先热稳定化变体
在上述计算机优先级排序（NetSurfP 背景；图 1B–C）和在 65 °C 进行的初步活性筛选（图 2A–B）指导下，选择一部分可溶性单点变体进行定量验证。测试的替换涵盖两种主要结构背景：溶剂暴露的表面环（A59 和 S199T）和若干外周 α-螺旋位置（I87、S154、Q159 和 H193），V223 作为额外的螺旋位点候选纳入。
65 °C 的定量比较显示，所有入围单点变体在归一化至 WT 对照（WT = 100%；图 2C）时均显示出比 WT 更高的相对活性。A59P 表现出最大改善（相对于 WT 为 13 倍），其次是 Q159K（7 倍）和 I87L（3 倍）。S154A、H193R 和 S199T 显示中等增强（约 2 倍），而 V223W 在这些条件下未提供明显益处。为更直接评估热耐受性，在 55 °C 短时预孵育 5 min 后测量残余活性，随后进行标准化测定（2.5 节）。相对于 WT（WT = 100%），A59P 保持最高残余活性（170%；图 2D），而 I87L、Q159K 和 H193R 也显示出改善的残余活性（129–150%）。相反，S154A 表现出降低的残余活性（60%），表明改善的高温活性并不必然转化为所有替换的稳定性增加。
为探究稳定化效应是否可以组合，构建并评估了若干双变体（图 2E）。I87L/Q159K 在组合中表现最强；然而，在 A59P 背景上引入 I87L、Q159K 或 H193R 未产生明显的加性增益，在某些情况下甚至略微降低活性。总体而言，在测试条件下未观察到明显的协同效应，因此选择 A59P 作为领先候选进行详细生化表征和机理分析。缺乏加性可能反映上位性相互作用和/或局部堆积/静电权衡，表明进一步的组合设计应以结构和稳定性感知的筛选为指导。
残基 59 位于柔性溶剂暴露表面环（残基 57–71）内。Ala 被 Pro 替换预计会因吡咯烷环约束而限制骨架构象自由度，可能增加局部刚性并改善对热扰动的抵抗。与该结构背景一致，WT ZENM 和 A59P 的 AlphaFold3 衍生模型叠加突出了 57–71 环区域内的 A59P 替换（图 2F），推动了后续 MD 模拟以检查高温下环动力学如何改变。因此，A59P 被优先选择不仅因其优越的热稳定性，还因其扰动了一个明确定义的柔性表面环，为后续部分的机理阐释提供了结构上可处理的切入点。
【数据】65 °C相对活性（WT=100%）：A59P 13倍、Q159K 7倍、I87L 3倍、S154A/H193R/S199T约2倍、V223W无明显益处；55 °C预孵育5 min后残余活性（WT=100%）：A59P 170%、I87L/Q159K/H193R 129–150%、S154A 60%；双变体：I87L/Q159K最强，A59P背景上加I87L/Q159K/H193R无加性增益
3.3 A59P 变体的功能表征
如图 3A 所示，A59P 和野生型（WT）ZENM 在标准化终点法测定条件（pH 9.0、15 min）下显示出相同的表观最适温度（55 °C），表明 A59P 替换未改变温度最适点。A59P 在高温下保持了显著更高的相对活性。在 65 °C 时，A59P 保持 60% 相对活性，而 WT 降至 <10%；在 70 °C 时，A59P 仅检测到痕量活性，WT 基本无活性。A59P 和 WT 的 pH–活性曲线也可比（图 3B），两种酶均在 pH 9.0 显示最适值，在测试范围内趋势相似。
【数据】最适温度：A59P和WT均为55 °C；65 °C相对活性：A59P 60%、WT <10%；70 °C：A59P仅痕量活性、WT基本无活性；最适pH：A59P和WT均为pH 9.0
3.4 热挑战下的功能稳定性、耐酸性及 T50
在 55 °C、50 mM Tris–HCl（pH 9.0）中进行延长热挑战的残余活性时间进程，以及在 25 °C、200 mM 柠檬酸–Na₂HPO₄（pH 4.2）中进行酸灭活实验（图 4）。在 55 °C 和 pH 9.0 下，A59P 显示出 9.8 倍长的半衰期（27.84 min vs. WT 的 2.85 min）。A59P 的半灭活温度（T50）为 62.5 °C，比 WT 的 54.9 °C 高 7.6 °C。差示扫描荧光法（DSF）进一步显示，表观熔解温度从 WT 的 59.17 ± 1.17 °C 增加到 A59P 的 82.37 ± 1.34 °C，对应 ΔTm 为 +23.20 °C。
【数据】55 °C半衰期：A59P 27.84 min vs. WT 2.85 min（9.8倍）；T50：A59P 62.5 °C vs. WT 54.9 °C（+7.6 °C）；表观熔解温度（DSF）：WT 59.17 ± 1.17 °C、A59P 82.37 ± 1.34 °C；ΔTm：+23.20 °C；热挑战条件：55 °C、50 mM Tris–HCl、pH 9.0；酸灭活条件：25 °C、200 mM 柠檬酸–Na₂HPO₄、pH 4.2
3.5 分子动力学分析
在 323–343 K 下对 WT ZENM 和 A59P 变体进行全原子分子动力学模拟。200 ns 模拟过程中 Cα 均方根偏差（RMSD）的时间演化（图 5A、E）、逐残基均方根涨落（RMSF）（图 5B、F）、回转半径（Rg）（图 5C、G）和溶剂可及表面积（SASA）（图 5D、H）被监测。模拟结果表明，A59P 减弱了 57–71 环的热诱导涨落，限制了温度驱动的全局构象膨胀，并降低了 ZENM 对高温的结构敏感性，同时保持与 WT 总体相当的内部分子氢键水平。
【数据】模拟温度：323、333、343 K；模拟时长：200 ns；分析指标：RMSD、RMSF、Rg、SASA；平衡段：100–200 ns（用于氢键计算）
3.6 全局结构叠加与残基 59 局部环境比较
WT ZENM 和 A59P 围绕残基 59 的全局结构叠加和局部环境比较显示于图 6。图 6A 展示了 WT ZENM 和 A59P 的整体结构叠加，突出显示了残基 59 周围区域。图 6B 显示了 WT 结构的局部视图，展示了 Ala59 与邻近残基的空间关系。
【数据】结构比较方法：全局结构叠加；目标残基：59；结构来源：AlphaFold3预测模型
3.7 ZENM 和 A59P 内部分子氢键的温度依赖性
图 7 显示了野生型 ZENM（黑色方块）和 A59P 突变体（红色圆圈）在 323、333 和 343 K 下的平均蛋白质内部分子氢键数，计算基于分子动力学模拟的 100–200 ns 平衡段。
【数据】温度点：323、333、343 K；氢键计算区间：100–200 ns平衡段；比较对象：WT ZENM（黑色方块）vs. A59P（红色圆圈）
讨论与解读
本研究通过 FireProt/PROSS 引导设计、ΔΔG 筛选和基于结构过滤的集成计算–实验工作流，提升了 ZEN 内酯酶 ZENM 的热稳定性。在 33 个单点变体中，A59P 成为领先的热稳定化替换，同时保持 WT 样催化特性。在测试条件下，A59P 半衰期延长 9.8 倍，T₅₀ 提高 7.6 °C，表观熔解温度大幅增加（ΔTm = +23.20 °C）。MD 模拟表明，A59P 主要通过降低热诱导的结构敏感性、抑制 57–71 表面环的涨落和限制温度驱动的全局膨胀来提升热稳定性，而非通过显著增加总氢键数。这些发现支持通过脯氨酸替换实现环刚性化作为 ZEN 内酯酶及潜在其他 α/β-水解酶折叠脱毒酶的有效热稳定化策略。
编译者解读： 该研究的亮点在于将计算设计漏斗（约 5400→642→33）与实验验证紧密耦合，以较少实验量锁定单一优势位点 A59P。选择表面柔性环而非核心区进行脯氨酸替换，体现了"低风险、高回报"的工程逻辑——不扰动催化三联体，却换来 ΔTm 超 23 °C 的跃升。局限也明显：双变体无加性效应，说明该酶的热稳定化存在上位性壁垒，单点策略的天花板已现。未来若结合深度学习序列生成与高通量筛选，或可突破组合设计的瓶颈。
参考来源
期刊：Bioorganic Chemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110046
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110046