来源：Fermentation optimization of xylanase McXyn0243 from Malbranchea cinnamomea in Pichia pastoris and its application in whole wheat mantou（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全麦食品营养丰富，但麸皮颗粒的物理干扰和纤维对麸质网络的稀释效应导致面团加工性能差、产品质地粗糙。本研究将来自嗜热真菌 Malbranchea cinnamomea 的耐热木聚糖酶McXyn0243在毕赤酵母中异源表达，通过单因素实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡法和响应面法系统优化甲醇诱导条件，酶活从15.42 U/mL提升至56.6 U/mL（提高267%）。优化后的酶在pH 5.0–10.0范围内稳定，70°C下保持活性。将其以低剂量（5或25 U/g）应用于全麦馒头，可有效改善面团加工性能、降低硬度、增大比容并优化内部孔隙结构。
研究背景
随着营养科学的发展和公众健康意识的提高，全谷物食品因其独特的营养价值已成为现代膳食的重要组成部分。大量研究表明，全谷物富含膳食纤维、维生素、矿物质、植物化学物质和非淀粉多糖。增加全谷物摄入可降低心血管疾病、2型糖尿病和肥胖等慢性疾病的风险，这主要归因于非淀粉多糖对肠道菌群的调节作用以及抗氧化成分对代谢综合征的改善[1,2]。
全麦馒头是中国传统蒸制面食，也是重要的全谷物主食，其营养价值显著高于精制小麦粉馒头。然而，尽管全谷物食品的健康益处明确，全麦面粉在食品加工中的应用仍受限于其较差的加工性能和终产品质量。在全麦面团体系中，纤维的存在增加了吸水率和产气能力，但对面团稳定性和馒头体积等关键品质产生负面影响[3]。具体而言，麸皮颗粒的物理干扰、纤维对麸质网络的稀释效应以及纤维、蛋白质和淀粉之间的水分竞争，往往导致面团稳定性降低和持气能力下降，使面团变硬、弹性减弱。
木聚糖酶能水解全麦面团中阿拉伯木聚糖的水不溶性组分，改善面团流变学特性和产品品质。本研究旨在通过系统优化McXyn0243在毕赤酵母中的发酵条件提高其产量，并评估其在全麦馒头中的应用效果。
研究方法
2.1 菌株与培养基
大肠杆菌DH-5α用于质粒操作，在Luria-Bertani（LB）培养基（0.5%酵母提取物、1%蛋白胨、1% NaCl）中培养。毕赤酵母GS115在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中培养，用作蛋白表达宿主。根据Invitrogen毕赤酵母表达试剂盒手册制备以下培养基：最小葡萄糖（MD）培养基（2%葡萄糖、1.34%酵母氮源（YNB）、4×10⁻⁵%生物素、1.5%琼脂）；缓冲甘油复合（BMGY）培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素），用于毕赤酵母培养；缓冲甲醇复合（BMMY）培养基（以0.5%甲醇替代甘油，其余成分与BMGY相同），用于诱导表达。
【数据】菌株：大肠杆菌DH-5α、毕赤酵母GS115；培养基：LB（0.5%酵母提取物、1%蛋白胨、1% NaCl）、YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）、MD（2%葡萄糖、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素、1.5%琼脂）、BMGY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1%甘油、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素）、BMMY（0.5%甲醇替代甘油）；温度：原文未详述
2.2 质粒构建
来自 M. cinnamomea F408的木聚糖酶基因McXyn0243通过PCR扩增，使用引物对Xyn0243EcoRI（正向：5'-CCGGAATTCATGGTCGGTTTTACCTCCTTTGCC-3'，EcoR I限制性位点以下划线标出）和Xyn0243NotI（反向：5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGCCGACGTCGGCGACG-3'，Not I限制性位点以下划线标出），方法如前期研究所述[15]。所得PCR产物两端带有EcoR I和Not I位点，连接至分泌表达载体pPIC9K。重组质粒命名为pPIC9K-McXyn0243，导入大肠杆菌DH5α，在含50 µg/mL Amp的LB琼脂平板上筛选。阳性克隆通过测序确认插入片段完整性和限制性位点。潜在N-连接糖基化位点使用NetNGlyc 1.0预测，该软件评估Asn-X-Ser/Thr基序的序列背景，其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸。潜在O-连接糖基化位点使用NetOGlyc 4.0基于丝氨酸和苏氨酸残基的局部序列背景进行预测。
【数据】质粒：pPIC9K-McXyn0243；抗生素：50 µg/mL Amp；限制性酶：EcoR I、Not I；软件：NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0；温度：原文未详述；时间：原文未详述
2.3 毕赤酵母的转化与筛选
电感受态毕赤酵母GS115细胞根据毕赤酵母表达试剂盒方案稍作修改制备。挑取划线于YPD平板上的毕赤酵母GS115单菌落，接种于YPD培养基中。30°C、180 rpm振荡培养过夜。然后将过夜培养物的0.5%转接至200 mL YPD培养基中，30°C、180 rpm振荡培养至OD₆₀₀达到1.3–1.5。预冷培养细胞悬液、无菌水、山梨醇及实验所需其他材料。将细胞培养物于4°C、5000 rpm离心5 min，弃上清。用200 mL冰预冷无菌水重悬沉淀，4°C、5000 rpm离心5 min，弃上清。用100 mL冰预冷无菌水重悬，4°C、5000 rpm离心5 min，弃上清。用20 mL冰预冷山梨醇重悬，4°C、5000 rpm离心5 min，弃上清。最后用0.4 mL冰预冷山梨醇重悬沉淀，每管80 µL分装至1.5 mL微量离心管中。重组质粒（pPIC9K-McXyn0243）使用限制性内切酶Sal I线性化。使用Bio-Rad GenePulser Xcell™电穿孔系统（Hercules, CA, USA）将10 µg线性化构建体电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中。最优转化参数包括：单脉冲2.0 kV（电场强度10.0 kV/cm，0.2 cm电击杯间隙）、200 Ω电阻、6 ms脉冲持续时间。电击后恢复通过将细胞重悬于1 M冰预冷山梨醇中，30°C温和振荡（150 rpm）孵育60 min完成。随后取100 µL涂布于含Geneticin 418（G-418；Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA）的MD琼脂平板上，终浓度0.5 mg/mL。平板30°C倒置培养72 h以形成菌落，定期监测表型特征。
【数据】菌株：毕赤酵母GS115；质粒：pPIC9K-McXyn0243（10 µg线性化）；限制性酶：Sal I；电转化参数：2.0 kV、200 Ω、6 ms、0.2 cm电击杯；抗生素：0.5 mg/mL G-418；温度：30°C（培养）、4°C（离心）；转速：180 rpm（培养）、150 rpm（恢复）、5000 rpm（离心）；时间：过夜培养、60 min恢复、72 h平板培养；OD₆₀₀：1.3–1.5；分装体积：80 µL；涂布体积：100 µL
2.4 McXyn0243的表达
从MD琼脂平板分离重组毕赤酵母克隆，分别接种至含5 mL BMGY的25 mL摇瓶中。30°C、180 rpm振荡培养12 h。4°C、5000 × g离心5 min收集细胞生物量，重悬于5 mL BMMY中，30°C、180 rpm振荡培养48 h。通过每24 h补充100%（v/v）甲醇至终浓度0.5%（v/v）启动甲醇诱导，持续5天。诱导期间培养物维持30°C、连续振荡（180 rpm）。对于重组蛋白表达的动力学分析，每天在相同时间点（如24 ± 2 h间隔）从各培养物中取出500 µL等分试样。4°C、12000 × g离心10 min去除细胞碎片，上清液立即使用以山毛榉木聚糖为底物的标准方法测定木聚糖酶活性。
【数据】培养基：BMGY（5 mL）、BMMY（5 mL）；甲醇终浓度：0.5%（v/v），每24 h补充；温度：30°C（培养）、4°C（离心）；转速：180 rpm（培养）、12000 × g（离心）；时间：12 h预培养、48 h诱导、5天总诱导期；取样体积：500 µL；底物：山毛榉木聚糖
2.5 McXyn0243产量的优化
对于木聚糖酶生产，将木聚糖酶活性最高的转化子按以下方式培养：单菌落首先接种至10 mL YPD中，30°C、180 rpm振荡培养24 h。活化后，预培养物以1%（v/v）接种量转接至25 mL BMGY中，相同条件（30°C、180 rpm）孵育48 h。随后4°C、5000 × g离心5 min收集细胞。沉淀重悬于BMMY中，每天补充甲醇至终浓度1%（v/v）以维持蛋白表达。培养物维持30°C、连续振荡（180 rpm），总诱导期5天。
【数据】培养基：YPD（10 mL）、BMGY（25 mL）、BMMY；接种量：1%（v/v）；甲醇终浓度：1%（v/v），每日补充；温度：30°C（培养）、4°C（离心）；转速：180 rpm（培养）、5000 × g（离心）；时间：24 h预培养、48 h生长、5天诱导期
#### 2.5.1 单因素设计
使用单因素实验设计系统优化甲醇诱导木聚糖酶生产的发酵参数（补充表S1）。评估变量包括甲醇浓度、预诱导期、接种量、YNB浓度、摇床转速、BMMY初始pH、诱导后温度、诱导后时间、BMMY工作体积和甘油浓度。每个参数独立优化，同时保持其他变量恒定。所有培养均在含25 mL BMMY的250 mL锥形瓶中进行，设三个平行，通过每日添加指定浓度甲醇维持诱导。
【数据】容器：250 mL锥形瓶；工作体积：25 mL BMMY；平行数：3；变量：甲醇浓度、预诱导期、接种量、YNB浓度、摇床转速、初始pH、诱导后温度、诱导后时间、工作体积、甘油浓度；温度/时间/转速：随变量设定，原文未详述具体值
#### 2.5.2 PB设计
基于单因素优化结果，使用Minitab 17.1软件实施PB实验设计，评估影响木聚糖酶生产的7个关键变量。研究因素包括：甲醇浓度（X1）、预诱导期（X2）、接种量（X3）、YNB浓度（X4）、诱导后温度（X5）、诱导后时间（X6）和甘油浓度（X7）。每个因素评估两个编码水平：高（+1）和低（-1），具体范围详见补充表S2。实验设计矩阵包含15次运行（N = 15），以McXyn0243活性（U/mL）为响应变量。实验执行后，进行多元线性回归分析，建立描述所选因素与酶活性关系的一阶模型。模型项的统计显著性使用方差分析（ANOVA）在α = 0.05水平评估，通过残差诊断确认模型 adequacy。
【数据】软件：Minitab 17.1；因素数：7（X1–X7）；水平：高（+1）、低（-1）；运行数：N = 15；响应变量：McXyn0243活性（U/mL）；显著性水平：α = 0.05；温度/时间/转速：原文未详述
#### 2.5.3 最陡爬坡路径设计
基于PB设计获得的回归模型，筛选出对McXyn0243活性有显著影响的5个因素。根据这些因素对McXyn0243活性的效应和实验经验设定变化方向和步长，设计最陡爬坡路径以进一步优化。
【数据】因素数：5；方法：最陡爬坡路径设计；温度/时间/转速：原文未详述
研究结果
3.1 重组木聚糖酶McXyn0243在毕赤酵母中的表达
将编码McXyn0243的全长核苷酸序列克隆至pPIC9K表达载体，重组质粒经Sal I限制性内切酶线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞。甲醇诱导后，超过100个快速生长的转化子在5 mL BMGY/BMMY培养基中培养，培养上清液使用DNS法以山毛榉木聚糖为底物筛选木聚糖酶活性。仅18个转化子（补充表S4）显示可检测的木聚糖酶活性（> 0.2 U/mL），其中三个分离株（McXyn0243-16、-17、-18）表现出相对较高的活性（> 10 U/mL）。选择产量最高的菌株McXyn0243-17（15.42 U/mL）用于后续表征。Basotra等[17]报道了来自 M. cinnamomea 的GH10和GH11木聚糖酶在毕赤酵母X-33中的异源表达，最高活性分别为24.3和573.32 U/mL，这是该嗜热真菌GH11和GH10木聚糖酶在毕赤酵母中异源表达成功的唯一文献记录。然而，最近McXyn0243已在大肠杆菌中表达和表征，其在该原核宿主中的重组生产条件也已被优化[15,44]。综合现有文献表明，关于 M. cinnamomea 木聚糖酶的研究正在增加，但其在毕赤酵母中的表达研究仍然很少。他们的研究显示，产量最高的GH11木聚糖酶转化子达到573.32 U/mL活性，显著超过本研究观察到的水平。这种显著差异可能源于所用表达载体的不同。值得注意的是，他们表达的GH10木聚糖酶也表现出相对较低的活性（24.3 U/mL）。跨真菌属的比较分析表明，来自 M. cinnamomea 的木聚糖酶相对于其他嗜热真菌的同源物通常表现出较低的表达产量，这一现象可能归因于影响异源宿主中重组蛋白生产效率的内在基因序列特征[17–19]。该酶的适度表达产量对其生物技术应用施加了显著限制，特别是在需要高通量生产的工业规模过程中。为克服这一限制，我们启动了针对关键发酵变量的结构化优化方案以最大化重组蛋白产量。
【数据】转化子总数：>100；有活性转化子：18（>0.2 U/mL）；高活性转化子：3（>10 U/mL）；最高产量菌株：McXyn0243-17（15.42 U/mL）；文献对比：GH11 573.32 U/mL、GH10 24.3 U/mL；培养基：BMGY/BMMY（5 mL）；底物：山毛榉木聚糖；方法：DNS法
3.2 毕赤酵母中木聚糖酶McXyn0243表达的发酵条件优化
#### 3.2.1 单因素设计
##### 3.2.1.1 诱导后温度对McXyn0243活性的影响
根据商业表达试剂盒说明，毕赤酵母培养期间的最佳生长温度维持在28–30°C。超过32°C的高温已被证明对蛋白表达诱导产生不利影响，并可能诱导细胞死亡。然而，越来越多的证据表明，在诱导阶段将培养温度从标准30°C降至20°C可增强重组蛋白产量[20]。这种温度调节改善细胞活力，减轻与蛋白错误折叠相关的内质网应激，并增加mRNA和蛋白稳定性。此外，较低孵育温度减少目标蛋白的蛋白水解降解，这可能是由于内源性蛋白酶活性降低。低温下异源蛋白合成速率降低被认为为正确蛋白折叠提供了充足时间，从而保持内质网折叠能力并增强整体细胞活力[21–23]。需要注意的是，异源蛋白的最佳表达温度可能因具体目标蛋白而异[24]。如图1a所示，McXyn0243活性表现出温度依赖性响应，在30°C培养时达到峰值17.42 U/mL，与制造商建议一致。生物量测定显示，与最佳条件（30°C）相比，亚适温度（24–28°C）更有利于酵母生长。然而，在这些条件下观察到的McXyn0243活性降低可能归因于蛋白合成速率下降。在高温（32°C）下，观察到生物量显著减少，与酶活性降低相关。此外，32°C下培养pH升高表明可能存在细胞裂解，可能导致蛋白酶泄漏和随后的目标蛋白降解。这些发现表明，高于32°C的温度诱导多种应激响应，包括活力降低、代谢功能障碍和蛋白水解不稳定性，最终损害重组蛋白生产。
【数据】温度：30°C（最佳，17.42 U/mL）、24–28°C（亚适）、32°C（高温胁迫）；活性峰值：17.42 U/mL；pH：32°C下升高；生物量：32°C下显著减少
##### 3.2.1.2 摇床转速和工作体积对McXyn0243活性的影响
甲基营养型酵母毕赤酵母表达系统在醇氧化酶（AOX1）启动子的严格调控下运行，需要在甲醇利用阶段维持高溶解氧（DO）张力[25]。这一需求源于两个氧依赖过程：（1）AOX1编码的酶需要分子氧作为甲醇氧化的共底物；（2）细胞呼吸需要充足氧气通过电子传递链维持ATP生产。在摇瓶系统中，摇床转速和工作体积是DO调节的关键参数，其优化对于最大化重组蛋白产量至关重要。提高振荡速度和减少工作体积通过改善液-气界面氧传质协同增强DO水平。然而，这种组合诱导流体动力学剪切应力，损害细胞膜完整性并触发细胞内蛋白酶释放，降解异源蛋白。如补充图S2a所示，McXyn0243活性在140–200 rpm范围内与振荡强度呈强正相关。摇床转速从140 rpm增加至200 rpm导致生物量（OD₆₀₀）增加41.5%，重组酶活性同步上升，在200 rpm时达到最大值19.11 U/mL。这证实高DO条件有利于毕赤酵母中McXyn0243的生产。虽然先前研究报道某些重组蛋白在250–300 rpm下产量更优[26]，但我们的轨道摇床在超过200 rpm持续运行导致过早机械故障。考虑设备寿命和工艺重现性，选择200 rpm作为后续实验的标准振荡参数。补充图S2b显示，将工作体积从50 mL降至10 mL/250 mL（烧瓶容量的4%）使McXyn0243活性增加64.3%（14.67 U/mL vs. 24.11 U/mL）。这种增强归因于三个机制：（1）降低液柱高度改善氧扩散效率；（2）增加表面积与体积比增强气体交换；（3）减少代谢废物积累（如乙醇）减轻对细胞代谢的抑制作用[27]。尽管极端工作体积（如5 mL/250 mL）可能进一步优化产量，但我们的250 mL烧瓶在低于10 mL时出现严重液体晃动，导致DO不稳定。基于容器设计限制和操作稳定性，确定10 mL/250 mL为最佳工作体积，平衡氧传递效率与工艺控制。
【数据】转速范围：140–200 rpm；转速提升：140→200 rpm，生物量增加41.5%，活性19.11 U/mL；工作体积：50 mL→10 mL/250 mL（4%烧瓶容量），活性增加64.3%（14.67→24.11 U/mL）；最佳转速：200 rpm；最佳工作体积：10 mL/250 mL；温度：原文未详述；时间：原文未详述
##### 3.2.1.3 甲醇浓度对McXyn0243活性的影响
甲醇是毕赤酵母发酵系统中的主要碳源和诱导剂，其浓度对细胞代谢和重组蛋白产量均有关键影响[28]。
【数据】碳源/诱导剂：甲醇；温度/时间/转速：原文未详述
讨论与解读
本研究通过单因素实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡法和响应面法的系统策略，成功优化了耐热木聚糖酶McXyn0243在毕赤酵母中异源表达的发酵条件，验证酶活达到56.6 U/mL——较优化前基线（15.42 U/mL）和大肠杆菌表达系统（29.89 U/mL）均有大幅提升。优化后的McXyn0243表现出宽pH稳定性（5.0–10.0）和热稳定性（≤ 70°C），这是工业规模酶应用的关键特性。应用于全麦馒头生产时，McXyn0243在低剂量（5或25 U/g面粉）下表现出明显的剂量依赖性益处，改善面团加工性能、降低产品硬度、提高比容和内部均匀性，凸显其改善全谷物产品质构和感官品质的潜力。未来工作将聚焦于密码子优化和发酵罐规模工艺开发，以进一步提高表达水平并支持该酶在全谷物食品加工中的工业转化。
编译者解读：该研究的方法学价值在于将经典的Plackett-Burman结合响应面策略应用于毕赤酵母甲醇诱导表达系统，以较低成本实现了267%的产量提升。然而，56.6 U/mL的最终酶活仍远低于文献报道的同源GH11木聚糖酶（573.32 U/mL），提示该基因在毕赤酵母中的表达瓶颈可能源于密码子偏好性或分泌效率，而非单纯的发酵条件。从应用角度看，低剂量（5 U/g）即可改善全麦馒头品质，具备成本可行性，但发酵罐放大和酶制剂稳定性验证仍是产业化的必经环节。
参考来源
期刊：Process Biochemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.09.007
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.09.007