来源：Tailored base editing toolkits for functional genomics and metabolic engineering in the halophile Salinivibrio（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
嗜盐菌可在开放非无菌条件下发酵，具备天然抗污染优势，是可持续生物制造的潜力底盘。但其遗传操作工具匮乏，严重制约了代谢工程与功能基因组研究。本研究在工业前景良好的嗜盐菌Salinivibrio sp. TGB4中建立了高效的碱基编辑平台，腺嘌呤与胞嘧啶碱基编辑器（ABE和CBE）均获验证，可实现单位点、双位点及三位点替换。ABE效率高、PAM兼容性广；CBE可精准实现C→T替换；新型融合蛋白PmCDA-TadA8e-nCas9-UGI支持A→G与C→T的协同双碱基编辑。研究者进一步用该系统解析了乙酸代谢，鉴定出acs1为乙酸同化与PHB合成的主效基因。
研究背景
嗜盐细菌能在开放、非无菌条件下发酵，且天然抗污染，正被视为有前景的微生物细胞工厂。然而，这类非模式宿主的遗传可操作性仍是根本瓶颈，严重限制了通路工程与功能基因组学的潜力。CRISPR介导的碱基编辑无需双链断裂即可实现精准单核苷酸替换，为无痕基因组工程提供了有力手段。CBE与ABE已广泛应用于哺乳动物细胞、植物和模式微生物，推动了功能基因组学、疾病建模和代谢工程的发展。但它们在非模式微生物中的潜力仍大多未被探索。此前的初步尝试已证实了这些挑战——常规编辑器架构在某些物种中无效，特别是Cas9介导的DNA切割会导致Vibrio natriegens细胞死亡。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究使用的所有菌株列于表S1。野生型Salinivibrio sp. TGB4最初从中国天津滨海新区盐场分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（保藏号21105）。其完整基因组序列存于NCBI GenBank数据库，登录号GCA_027286385.1。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，大肠杆菌S17–1作为接合供体菌。所有化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司（中国北京），为分析纯。大肠杆菌菌株在LB培养基（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中37°C培养。Salinivibrio sp. TGB4在TYS培养基（27.5 g/L NaCl、5 g/L胰蛋白胨、1 g/L酵母提取物、0.7 g/L KCl、5.4 g/L MgCl₂·6H₂O、6.8 g/L MgSO₄·7H₂O、1.05 g/L CaCl₂和0.2 g/L NaHCO₃）中于相同温度条件下培养。
【数据】菌株：Salinivibrio sp. TGB4（保藏号21105，基因组登录号GCA_027286385.1）；培养基：LB（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）、TYS（27.5 g/L NaCl、5 g/L胰蛋白胨、1 g/L酵母提取物、0.7 g/L KCl、5.4 g/L MgCl₂·6H₂O、6.8 g/L MgSO₄·7H₂O、1.05 g/L CaCl₂、0.2 g/L NaHCO₃）；温度：37°C；原文未详述其他参数。
2.2 质粒构建与gRNA设计
所用全部质粒和引物分别列于表S1和表S2。DNA片段使用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（诺唯赞生物，中国）扩增，PCR产物用凝胶回收试剂盒（Omega Biotek，美国）纯化。线性DNA片段通过Gibson组装法组装为环状质粒。基于nCas9（D10A）骨架，融合了两种功能脱氨酶：PmCDA和UGI用于胞嘧啶碱基编辑（CBE），TadA8e用于腺嘌呤碱基编辑（ABE）。编辑模块克隆入载体pSEVA341S，由来自化脓性链球菌的天然Cas9启动子控制。sgRNA表达盒整合到同一质粒中，得到CBE和ABE构建体。为实现同时多位点编辑，设计了可串联表达两个或三个sgRNA的质粒。为开发ACBEs（腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑系统），设计了三种不同的nCas9-脱氨酶融合构型：（1）N端PmCDA与C端TadA8e融合；（2）C端PmCDA与N端TadA8e融合；（3）两种脱氨酶共定位于nCas9的N端。所有融合蛋白表达单元克隆入pSEVA341S载体，由Cas9启动子控制。sgRNA序列使用专业CRISPR设计工具优化和选择，由强组成型启动子J23119驱动表达。为研究乙酸利用基因在Salinivibrio sp. TGB4中的作用，采用胞嘧啶碱基编辑器在候选基因编码区引入提前终止密码子。靶向失活的具体基因根据其参与乙酸摄取和代谢的功能进行选择。设计引物以创建靶向各基因的guide RNA（gRNA）。碱基编辑器构建体通过接合导入Salinivibrio sp. TGB4。
【数据】质粒：pSEVA341S；骨架：nCas9（D10A）；脱氨酶：PmCDA、UGI、TadA8e；启动子：天然Cas9启动子（来自化脓性链球菌）、J23119；融合构型：3种ACBE架构；原文未详述其他参数。
2.3 Salinivibrio sp. TGB4中的碱基编辑
质粒首先转化入大肠杆菌S17–1，然后通过接合转移入Salinivibrio。含质粒的大肠杆菌S17–1和Salinivibrio分别在天LB和TYS培养基中过夜培养。过夜培养物以2%接种量接种到新鲜培养基中，培养4 h。取1 mL培养物在5500 rpm离心2 min收集菌体，然后用新鲜培养基洗涤两次。两菌株按1:1比例混合，涂布于LB平板，37°C孵育8 h以允许质粒转移。最后，将混合物涂布于含60 g/L NaCl和抗生素的LB平板，37°C孵育36 h筛选接合子。为确保无偏评估，直接从选择琼脂平板上随机挑取独立单菌落，随后对靶位点进行PCR扩增和DNA测序分析。
【数据】接种量：2%；培养时间：4 h；离心：5500 rpm、2 min；混合比例：1:1；接合时间：37°C、8 h；筛选条件：60 g/L NaCl+抗生素、37°C、36 h；原文未详述其他参数。
2.4 突变检测与分析
使用序列特异性引物PCR扩增目标基因编辑区域以确保高特异性。PCR产物纯化去除杂质后进行Sanger测序。使用SnapGene软件（v8.0.3）进行序列比对和分析，该软件提供自动峰识别和编辑碱基的准确鉴定。为评估编辑效率，从涂布于LB琼脂的编辑培养物中挑取十个单菌落。对每个菌落的靶区域进行PCR扩增和测序。每个protospacer位置的编辑效率根据编辑读数的比例计算，菌落间的平均效率代表整体编辑性能。为评估碱基编辑器的基因组特异性，通过Cas-OFFinder在Salinivibrio sp. TGB4基因组中计算机预测潜在脱靶位点，使用最多五个错配的宽松阈值。选择与gRNA序列同源性最高的位点进行实验验证。从确认含有在靶编辑的独立克隆中提取基因组DNA。随后对这些高风险脱靶区域进行PCR扩增和Sanger测序分析，筛查附带碱基替换或插入缺失。
【数据】软件：SnapGene v8.0.3；单菌落数：10个；错配阈值：最多5个；原文未详述其他参数。
2.5 摇瓶发酵
Salinivibrio sp. TGB4首先划线于TYS琼脂平板，37°C孵育24 h。然后挑取单菌落接种到TYS液体培养基中。培养物在37°C、200 rpm振荡培养12 h，随后进行两轮传代培养以确保菌株活化。随后，将二次活化的种子培养物接种到补充有30至120 g/L乙酸浓度的TYS培养基中。接种前将培养基初始pH调至7.0。发酵过程中监测pH并定期调至7.0，以缓解乙酸同化引起的严重碱化。发酵在250 mL烧瓶中进行，30°C、200 rpm振荡。评估乙酸耐受性时使用250 mL圆底烧瓶。评估突变株乙酸利用时使用250 mL挡板三角烧瓶。
【数据】划线培养：37°C、24 h；活化培养：37°C、200 rpm、12 h；传代：2轮；乙酸浓度：30–120 g/L；初始pH：7.0；发酵温度：30°C；转速：200 rpm；容器：250 mL烧瓶/圆底烧瓶/挡板三角烧瓶；原文未详述其他参数。
2.6 发酵液分析与PHB定量
使用分光光度计测定600 nm光密度（OD600）。乙酸浓度通过高效液相色谱（HPLC）使用HPX87H柱（BioRad）测定。流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.6 mL/min，柱温55°C。检测器为示差折光（RID）检测器。取20 mL发酵培养液在10,000 rpm离心5 min，弃上清。菌体在−20°C冷冻12 h。随后使用冻干机冻干12 h，用精密电子天平测定干重。约20 mg干菌体和适量PHB标准品置于高温酯化管中。加入2 mL酯化液（由485 mL甲醇、15 mL硫酸和1 g苯甲酸混合配制）和2 mL氯仿。混合物在100°C加热4 h进行酯化。酯化后，向体系中加入1 mL去离子水，振荡实现相分离。收集下层有机相，通过气相色谱（GC）分析。
【数据】检测波长：600 nm；HPLC柱：HPX87H；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：55°C；离心：10,000 rpm、5 min；冷冻：−20°C、12 h；冻干：12 h；干菌体量：约20 mg；酯化液：485 mL甲醇+15 mL硫酸+1 g苯甲酸；酯化：100°C、4 h；原文未详述其他参数。
研究结果
3.1 Salinivibrio sp. TGB4中ABE和CBE系统的建立与表征
最初尝试使用基于dCas9的架构在Salinivibrio sp. TGB4中建立碱基编辑系统，未能产生编辑事件。因此，我们开发了基于nCas9（D10A）的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑系统（图1A）。ABE编辑器通过将TadA8e融合到nCas9的N端生成。TadA8e是一种进化的大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶，具有高活性和宽编辑窗口。对于胞嘧啶编辑，CBE系统整合了PmCDA和UGI。PmCDA来源于海七鳃鳗，提供稳健的胞苷脱氨活性且非特异性编辑极少。UGI是来源于噬菌体PBS2的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂，共表达以抑制宿主的尿嘧啶DNA糖基化酶并防止C-to-T编辑的回复。两个系统均在与Salinivibrio sp. TGB4兼容的组成型启动子下表达。质粒通过接合成功导入，24–48 h后出现菌落。为验证碱基编辑系统，我们最初针对phaC基因（编码聚羟基脂肪酸酯合酶）进行位点特异性替换。为系统评估编辑效率和精度，设计了多个guide RNA（gRNA）靶向理论编辑窗口内含有腺嘌呤或胞嘧啶的不同基因组位点。CBE实现了高效的C-to-T转换，成功率为100%（图1B），而ABE的效率因编辑窗口内腺嘌呤位置而异（图1C）。
与其他细菌中的趋势一致，编辑结果取决于靶向的protospacer位置。ABE表现出宽的编辑窗口（位置4–10）用于高效A→G替换。虽然在phaC位点的初步测试表明C-to-T转换主要在位置3达到峰值，但随后跨多个代谢靶点的综合评估揭示CBE系统实际上具有更宽的活性窗口。此外，基于PmCDA的CBE表现出更宽松的序列上下文依赖性，在多种局部序列背景下实现高效率。这包括5′-GC-3′基序——APOBEC1等脱氨酶的传统"冷点"。为评估多重编辑能力，组装了携带串联sgRNA的构建体用于双位点和三位点编辑（图2A、3A）。在双位点编辑中，CBE同时进行的C→T转换显著下降至30%（图2B）。这种降低可能因为PmCDA的高催化活性在多个位点产生过量尿嘧啶中间体，压倒了内源性尿嘧啶修复机制和共表达的UGI。相反，ABE在两个位点维持了100%的同时A→G替换（图2C）。
受此鼓舞，我们测试了三位点ABE构建体，其显著实现了所有三个位点的100%同时编辑（图3B）。由于多重碱基编辑通常因细胞修复限制和sgRNA竞争而随靶位点增加效率下降，ABE持续100%的多重编辑效率凸显了其在Salinivibrio sp. TGB4中卓越的兼容性和有效性。
鉴于两种脱氨酶的高在靶效率，我们严格评估了潜在脱靶突变。通过Cas-OFFinder的计算机预测揭示了 exceptional 特异性，未鉴定到错配少于五个的基因组脱靶位点。随后对完全编辑克隆中10个最高风险位点（恰好含五个错配）的靶向DNA测序证实完全不存在意外基因组修饰（表S3和图S1）。总体而言，这些结果表明两种碱基编辑器均以高效率和精度发挥作用。嗜盐胞内环境并未阻碍nCas9-脱氨酶复合物，凸显了其对高盐条件的强大适应性。这一成功实施建立了可靠的基因组编辑工具箱，为非模式嗜盐细菌的未来代谢工程奠定了基础。
【数据】编辑效率：CBE单碱基C→T 100%；ABE双位点100%、三位点100%；CBE双位点降至30%；ABE编辑窗口：位置4–10；CBE峰值位置：位置3；脱靶预测：最多5个错配、10个最高风险位点；接合后菌落出现时间：24–48 h；原文未详述其他参数。
3.2 ABE介导碱基编辑的PAM依赖性
为评估PAM依赖性，使用包含经典NGG PAM变体（包括AGG、TGG、CGG和GGG）的一组靶位点测试ABE活性。测序显示AGG、TGG和CGG位点效率为100%，而GGG PAM仅产生50%转换。高效的A→G替换主要发生在protospacer的位置4至10之间，最大活性在位置4–8。在位置A4，AGG、TGG和CGG PAM的编辑始终完全，但GGG降低（图4）。这些发现表明，虽然ABE在Salinivibrio sp. TGB4中与多种NGG PAM变体兼容，但效率取决于PAM组成，GGG支持显著较低的活性。这一模式与SpCas9的分子识别机制一致，其中第二和第三个鸟嘌呤对PAM结合至关重要，第一个碱基调节氢键稳定性。因此，在实际gRNA设计中，应优先选择AGG、TGG或CGG PAM的位点，以避免GGG PAM相关的效率损失。尽管野生型SpCas9衍生的ABE在Salinivibrio sp. TGB4中在AGG、TGG和CGG等最佳PAM条件下表现出稳健的编辑性能，但其对NGG PAM的严格依赖仍限制了可及基因组靶点的数量。工程化Cas9变体包括SpRY、xCas9和SpG已被证明可识别更宽松的PAM序列。因此，在Salinivibrio sp. TGB4或其他嗜极微生物中评估这些变体有望大幅扩展可编辑靶点范围，并可能实现近全基因组的碱基编辑。重要的是，此类工作还应评估其在这些宿主特有的高盐条件下的稳定性、活性和脱靶效应。
【数据】PAM效率：AGG 100%、TGG 100%、CGG 100%、GGG 50%；编辑窗口：位置4–10；最大活性：位置4–8；原文未详述其他参数。
3.3 面向Salinivibrio sp. TGB4的功能性双碱基编辑器工程化
我们接下来旨在实现单个编辑窗口内同时C→T和A→G替换，这一能力将极大加速组合基因组工程。最初尝试采用文献报道的架构（TadA8e-dCas9-AID）在Salinivibrio sp. TGB4中未能产生任何编辑菌落，凸显了现有设计在这种嗜盐宿主中的不足。随后，我们通过构建和测试三种额外架构探索融合拓扑的影响，包括PmCDA-nCas9-TadA8e-UGI、TadA8e-nCas9-PmCDA-UGI和PmCDA-TadA8e-nCas9-UGI（图5A）。只有PmCDA-TadA8e-nCas9-UGI构型产生功能性双编辑，产生同时含两种替换类型的菌落（图5B）。这一结果表明双编辑在Salinivibrio细菌中可行，但高度依赖脱氨酶结构域的空间排列。N端PmCDA-TadA8e融合在Salinivibrio sp. TGB4中的成功与其他细菌中的发现一致。例如，TadA-dCas9-AID被报道可在谷氨酸棒杆菌中实现同时碱基替换，在枯草芽孢杆菌中，ABE8e-CDA-nCas9和CDA-ABE8e-nCas9架构均支持双编辑，其中ABE8e-CDA-nCas9构型效率更高。这些平行现象表明N端融合策略可能在不同物种间具有普遍优势。一种可能的机制解释是脱氨酶的N端定位有利于其空间接近单链D
【数据】融合构型：PmCDA-nCas9-TadA8e-UGI、TadA8e-nCas9-PmCDA-UGI、PmCDA-TadA8e-nCas9-UGI；功能性构型：PmCDA-TadA8e-nCas9-UGI；文献架构TadA8e-dCas9-AID：未产生编辑菌落；原文未详述其他参数。
3.4 CBE应用于乙酸代谢与PHB生物合成研究
为展示该工具箱在代谢通路分析中的实用性，我们应用CBE系统研究Salinivibrio sp. TGB4的乙酸代谢。通过胞嘧啶碱基编辑器在候选基因编码区引入提前终止密码子实现功能基因失活。评估了TGB4在不同乙酸浓度下的生长（图6A）、生物量和PHB产量（图6B）以及乙酸消耗曲线（图6C）。对基因敲除突变体的生长（图6D）以及生物量和PHB产量（图6E）进行了评估。功能基因失活鉴定出acs1为在所评估培养条件下负责乙酸同化和PHB生产的主导基因。我们的研究强调了TGB4在通常对大多数传统工业微生物具有抑制性的高浓度乙酸下利用乙酸的强大能力。
【数据】乙酸浓度范围：30–120 g/L；鉴定基因：acs1；原文未详述其他具体数值。
讨论与解读
本研究在嗜盐菌Salinivibrio sp. TGB4中建立了高效的CRISPR/nCas9介导的碱基编辑系统。所得ABE和CBE系统均实现了精准单碱基替换，效率高达100%，在这一非模式生物中展现出强大活性。ABE系统表现出优越的多重编辑能力，可高效实现双位点甚至三位点编辑，而CBE在多重编辑情境下效果较差。PAM兼容性分析显示，ABE在AGG、TGG和CGG PAM下维持高效率，但在GGG位点活性降低。此外，我们证明了使用工程化双碱基编辑器同时进行C→T和A→G替换的可行性。在工具开发之外，我们应用CBE系统研究乙酸代谢。功能基因失活鉴定出acs1为在所评估培养条件下负责乙酸同化和PHB生产的主导基因。本研究凸显了TGB4在通常对大多数传统工业微生物具有抑制性的高浓度乙酸下利用乙酸的强大能力。这项工作不仅提供了多功能的基因组编辑平台，也展示了其在代谢通路解析和工程化中的应用价值。
编译者解读： 该研究的亮点在于针对嗜盐非模式菌"工具匮乏"这一核心痛点，系统比较了ABE与CBE在Salinivibrio中的表现，并通过融合拓扑筛选找到了适配该宿主的双碱基编辑器架构。ABE在多重编辑中100%的效率尤为突出，提示高盐胞内环境可能对TadA8e活性有保护或促进作用。局限在于PAM仍依赖NGG、CBE多重编辑效率骤降，以及acs1主导地位的结论仅适用于所测乙酸浓度范围。后续若引入SpRY等宽松PAM变体并优化CBE表达强度，有望进一步释放该底盘在低成本碳源转化中的潜力。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.04.012
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.04.012