来源：Signal-amplified ECL biosensor for exosomes: Integrating Zr-MOF/Au nanoclusters with catalytic hairpin assembly（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
外泌体是液体活检的理想标志物，但现有检测方法受限于通量低、耗时长或设备昂贵。本研究开发了一种增强型电化学发光（ECL）生物传感器，将磁性富集与无酶催化发夹组装（CHA）信号放大相结合，以锆基金属有机框架/金纳米簇（Zr-MOF/AuNCs）纳米复合材料作为信号标签，实现了对肿瘤来源外泌体的高灵敏检测。该平台线性范围为6.12 × 10²–6.12 × 10⁷ particles/mL，检测限低至187.4 particles/mL，在复杂血清基质中表现出良好的回收率和特异性。
研究背景
外泌体是细胞释放的30–150 nm囊泡，携带脂质、蛋白质和核酸，其组成与来源细胞相似。它们自由循环于血液、唾液和尿液等易获取的体液中。在癌症中，外泌体不仅数量增多，还主动参与疾病扩散，因此成为癌症诊断和监测的非侵入性标志物来源。
现有外泌体检测方法如透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA），往往受限于通量低、耗时长、特异性不足或操作复杂。新兴的高通量平台如微流控、流式细胞术和表面增强拉曼散射（SERS）虽然多重检测能力优越，但依赖精密昂贵的仪器，阻碍了临床推广。
电化学发光（ECL）将电极表面的电化学反应转化为光学信号，兼具高灵敏度与操作简便、稳定性好、响应快速、背景噪声低等优势。因此，基于ECL的生物传感器正被积极开发用于外泌体检测。然而，该领域仍迫切需要进一步提升灵敏度和临床适用性的策略。
研究方法
2.1 材料
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）、谷胱甘肽（GSH）、二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒以及抗Alix、Flotillin、CD63、CD9、Calnexin抗体购自碧云天生物技术（上海，中国）。本工作中使用的所有寡核苷酸序列（列于表S1）由生工生物工程股份有限公司（上海，中国）合成。氯化锆（ZrCl₄）、六水合氯铂酸（H₂PtCl₆·6H₂O）、偏苯三酸、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、盐酸、磷钨酸、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自阿拉丁工业公司（上海，中国）。氯化钾（KCl）、铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆]）、三水合亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O）、三乙胺（TEA）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）和磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）购自北京化学试剂公司（北京，中国）。磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）缓冲液由10 mM Na₂HPO₄、2 mM NaH₂PO₄、137 mM NaCl和4.7 mM KCl组成。CelliGent外泌体去除胎牛血清（FBS，Hamilton，新西兰）购自科昊佳生物制品有限公司（武汉，中国）。1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上样缓冲液购自Biosharp（北京，中国）。快速PAGE凝胶制备试剂盒和Omni-ECL超灵敏化学发光试剂盒购自翊圣生物医学技术有限公司（上海，中国）。Difco™脱脂奶粉购自BD Biosciences（圣何塞，美国）。通用磁性EV分离试剂盒购自天津启悟科技有限公司（上海，中国）。人宫颈癌细胞（HeLa）和人胃癌细胞（SGC-7901）购自国家实验细胞资源共享平台（上海，中国）。
【数据】缓冲液：PBS（pH 7.4）含10 mM Na₂HPO₄、2 mM NaH₂PO₄、137 mM NaCl、4.7 mM KCl；细胞系：HeLa、SGC-7901；其他：原文未详述
2.2 AuNCs的合成与纯化
AuNCs按照先前报道的方法并稍作修改合成[43]。简言之，将HAuCl₄水溶液（29 mM，1 mL）和GSH溶液（50 mM，1 mL）与8 mL超纯水在室温下混合。10分钟后，将混合物加热至70–95°C，以500 rpm温和搅拌24小时。随后获得AuNCs水溶液。为纯化AuNCs，首先通过离心（8000 rpm，5分钟）去除悬浮杂质。然后将上清液使用Millipore超滤管（分子量截留，MWCO = 3 kDa）进行三轮洗涤，每轮将溶液浓缩至原始体积的25%，以去除游离离子和未反应的GSH。最后，用超纯水将溶液重悬至初始体积，得到纯化的AuNCs。所有稀释和超滤步骤均使用超纯水进行。
【数据】HAuCl₄浓度：29 mM；GSH浓度：50 mM；加热温度：70–95°C；搅拌速度：500 rpm；反应时间：24h；离心：8000 rpm、5min；超滤MWCO：3 kDa；浓缩比例：至原始体积25%
2.3 Zr-MOF/AuNCs的合成
Zr-MOF按照多孔MOF的修改版本，遵循优化程序合成[31]。简言之，将ZrCl₄（0.586 g）、1,2,4-苯三甲酸（偏苯三酸，0.584 g）和HCl（0.506 g）在超声和剧烈搅拌下溶解于15 mL DMF中，持续15分钟。随后加入12 mL DMF和300 μL乙酸，继续搅拌10分钟。然后将混合物转移至聚四氟乙烯内衬的高压釜中，在180°C加热24小时。冷却至室温后，所得沉淀用DMF和去离子水反复洗涤，随后在甲醇中搅拌12小时以去除残留反应物。最后，产物用水洗涤并重悬至终体积15 mL，得到Zr-MOF储备液。对于Zr-MOF/AuNCs复合物的形成，将1 mL Zr-MOF储备液与4 mL AuNCs混合并超声1小时。离心后，产物重悬于1 mL水中，储存于4°C。Zr-MOF/AuNCs储备液的浓度通过冻干后称重确定。纳米复合物中的金浓度通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定。
【数据】ZrCl₄：0.586 g；偏苯三酸：0.584 g；HCl：0.506 g；DMF：15 mL + 12 mL；乙酸：300 μL；超声搅拌：15 min；搅拌：10 min；水热温度：180°C；水热时间：24h；甲醇搅拌：12h；Zr-MOF储备液体积：15 mL；Zr-MOF/AuNCs混合比例：1 mL Zr-MOF + 4 mL AuNCs；超声：1h；储存温度：4°C
2.4 Zr-MOF/AuNCs-DNA纳米探针的制备
简言之，Zr-MOF/AuNCs纳米颗粒通过以下步骤与NH₂-DNA2（NH₂-H2）偶联。首先，将发夹NH₂-H2在95°C加热5分钟，然后冷却至室温以促进发夹结构形成。对于偶联反应，将200 μL Zr-MOF通过加入9.55 mg EDC和5.5 mg NHS活化，涡旋混合2小时。随后，将150 μL活化Zr-MOF溶液与50 μL 4 μM NH₂-H2溶液混合，在温和摇动下孵育过夜。偶联后，将混合物离心并重悬至终体积200 μL。所得纳米探针稀释四倍用于后续实验。
【数据】NH₂-H2加热：95°C、5min；EDC：9.55 mg；NHS：5.5 mg；活化涡旋：2h；Zr-MOF体积：150 μL；NH₂-H2：50 μL、4 μM；孵育：过夜；终体积：200 μL；稀释倍数：4倍
2.5 扩增回路的验证
通过天然PAGE分析验证外泌体引发的发夹DNA CHA扩增的可行性[44]。首先，将所有DNA样品与上样缓冲液混合。然后将混合物加载到12%聚丙烯酰胺凝胶上。在110 V恒定电压下进行电泳约1小时。分离后，凝胶用GelRed核酸染料染色，随后分析结果。
【数据】凝胶浓度：12%聚丙烯酰胺；电压：110 V；电泳时间：约1h；染色：GelRed核酸染料
2.6 从培养细胞中外泌体的分离
HeLa和SGC-7901细胞分别培养在含有Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640的培养皿中，补充10% FBS。细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育至约70–80%汇合度。然后用PBS缓冲液洗涤细胞三次，随后在无血清培养基中培养48小时。通过差速离心从条件培养基中分离外泌体，如先前报道[45]。上清液首先在300 × g离心10分钟以去除活细胞，然后在2000 × g离心10分钟以去除死细胞。随后，上清液通过100 kDa MWCO过滤器过滤以浓缩含外泌体的溶液。通过10,000 × g离心30分钟进一步清除细胞碎片。外泌体主要通过100,000 × g超速离心70分钟初步分离，沉淀通过重复超速离心（100,000 × g，70分钟）两次洗涤。最终沉淀重悬于PBS缓冲液中，储存于−80°C备用。对于TEM表征，外泌体按照已发表方案并稍作修改制备[46]。取5 µL外泌体等分试样与等体积4%多聚甲醛固定15分钟。然后将固定样品吸附到铜网上10分钟。去除多余液体后，铜网用0.2%磷钨酸负染30秒，随后用PBS缓冲液洗涤三次。铜网在室温下风干后成像。
【数据】培养基：DMEM（HeLa）、RPMI 1640（SGC-7901）；FBS：10%；培养条件：37°C、5% CO₂；汇合度：70–80%；无血清培养：48h；离心：300 × g、10min；2000 × g、10min；过滤：100 kDa MWCO；10,000 × g、30min；超速离心：100,000 × g、70min（重复2次）；储存：−80°C；TEM固定：4%多聚甲醛、15min；铜网吸附：10min；负染：0.2%磷钨酸、30s
2.7 ECL生物传感器的制备
首先，将玻碳电极（GCE，直径5 mm）用氧化铝粉末（0.3和0.05 μm）仔细抛光，随后用超纯水彻底冲洗以获得光学清洁表面。在电沉积之前，将风干电极浸入2 mL 1% HAuCl₄溶液中。然后通过施加−2.0 V恒定电位400秒将AuNPs沉积到GCE表面，产生具有最佳厚度的AuNPs层。随后，将发夹DNA1（H1，3 μM）在95°C热变性5分钟并逐渐冷却至室温以确保正确的二级结构形成。然后，将12 μL H1溶液在AuNP修饰电极上于4°C孵育过夜，以通过Au-S键促进共价连接。然后，将10 μL 1 mM巯基己醇（MCH）滴加到电极上……
【数据】GCE直径：5 mm；氧化铝粉末：0.3和0.05 μm；HAuCl₄：2 mL、1%；电沉积电位：−2.0 V；电沉积时间：400s；H1浓度：3 μM；H1热变性：95°C、5min；H1孵育：12 μL、4°C、过夜；MCH：10 μL、1 mM
研究结果
3.1 ECL生物传感器检测外泌体的原理
方案1展示了所提出的ECL生物传感器用于外泌体检测的基本设计原理。该系统采用通过自组装方法合成的Zr-MOF/AuNCs作为构建ECL生物传感平台的核心组件（方案1A）。多孔Zr-MOF通过水热法合成，表面带有羧基（-COOH）[31]。然后，谷胱甘肽封端的AuNCs通过静电相互作用附着到Zr-MOF上。最后，末端氨基（NH₂）修饰的H2 DNA通过EDC/NHS介导的-NH₂与-COOH之间的酰胺化反应共价偶联到Zr-MOF/AuNCs平台上。检测机制如方案1B所示。识别事件在外泌体与Apt（表S1）结合后启动，触发相应aDNA链的释放。这些释放的aDNA链随后激活基于CHA的扩增回路，最终产生用于信号读取的双链DNA杂交体[38]。CHA回路包含两个功能性发夹探针：H1（固定在GCE上作为捕获探针）和H2（修饰在Zr-MOF/AuNCs上作为信号探针）。在缺乏aDNA的情况下，两个发夹通过强分子内杂交保持在其闭合状态的动力学陷阱中，有效防止非特异性交叉反应。引入aDNA后，H1经历从发夹到开放状态的构象转换，触发CHA级联并促进H1-H2双链体的形成。值得注意的是，aDNA在此双链体形成过程中被再生，使其能够重复参与后续轮次的回路，从而产生大量H1-H2双链体以放大检测信号。所得的H1-H2双链体通过锚定的H1探针将Zr-MOF/AuNCs信号标签固定在GCE表面。这种界面组装随后使用TEA作为共反应物触发强大的“信号开启”ECL响应[47]。值得注意的是，ECL强度与外泌体浓度呈线性依赖关系，能够进行准确的定量分析。总体而言，这一策略性设计的平台将特异性分子识别与高效信号放大级联相结合，从而实现了外泌体检测灵敏度的显著增强。
【数据】Zr-MOF/AuNCs合成方法：自组装；AuNCs封端：谷胱甘肽；偶联方式：EDC/NHS酰胺化；共反应物：TEA；信号模式：信号开启；原文未详述具体数值
3.2 纳米材料的表征
Zr-MOF/AuNCs复合物的逐步合成通过多种技术验证（图1A）。高分辨TEM（图1C）和SEM（图S1A）显示Zr-MOF呈现均匀尺寸90.3 ± 6.0 nm，而荧光（图S2-2a）和TEM（图1B）图像确认形成了离散的GSH-AuNCs，平均直径为3.6 ± 0.7 nm。AuNCs成功负载到Zr-MOF上通过元素映射和ICP-OES得到证实。高分辨TEM（图1D）和SEM（图S1B）图像显示，Zr-MOF/AuNCs复合物比原始Zr-MOF呈现更粗糙的表面形态。这种形态变化可能源于静电相互作用促进了小而高密度的AuNCs的有效包封。与此一致，Zr-MOF/AuNCs（图1E）和原始Zr-MOF（图S1C）的比较能量色散X射线（EDX）映射清楚地证实了AuNCs掺入MOF框架中。此外，Zr-MOF/AuNCs储备液的浓度通过冻干后称重确定为0.11 g/mL。纳米复合物中的金浓度使用ICP-OES测定为1918 ppm（0.0019 g/mL）。据此，Zr-MOF/AuNCs中金的质量负载计算为1.73%。Zeta电位测量（图1F）为纳米复合物的成功组装提供了进一步证据。AuNCs、NH₂-H2和Zr-MOF的测量电位分别为+1.82 mV、−14.2 mV和−22.3 mV。AuNCs包封后，Zeta电位增至−12.6 mV，随后NH₂-H2修饰导致Zr-MOF/AuNCs-DNA的最终电位为−16.3 mV，确凿地证明了复合物的成功形成。光学表征显示GSH-AuNCs具有明显的紫外-可见吸收特征（图1G，曲线a）和以565 nm为中心的单色光致发光（PL）发射（图1G，曲线b）。相比之下，原始Zr-MOF在400–700 nm范围内未显示可检测的PL发射（图S1D）。重要的是，AuNCs的吸收（图1H，曲线a）和PL（图1H，曲线b）谱在负载到Zr-MOF后均未发生显著变化，证实了纳米复合材料的结构完整性。AuNCs特征的明亮黄色荧光（图S2-3a）的同时出现进一步证明了Zr-MOF/AuNC杂化物的成功形成。总体而言，这些系统表征验证了所设计的Zr-MOF/AuNCs的成功制备和所需光学性质。
AuNCs的成功掺入通过X射线光电子能谱（XPS）进一步验证，并对Zr和Au进行了详细的元素映射和定量分析。XPS测量谱（图2A）确认了复合材料中存在特征的Zr、N、C、O和Au元素。高分辨谱提供了上述元素化学状态的深入信息。C 1s谱（图2B）在288.7 eV（OC-O）、285.9 eV（C-O）和284.8 eV（C-C）处显示三个不同的峰，表明游离羧基的保留。同时，Zr 3d谱（图2C）在184.6 eV（Zr 3d3/2）和182.2 eV（Zr 3d5/2）处显示明确的双峰，与Zr基MOF的完整结构一致[31]。值得注意的是，Au 4f谱（图2D）在87.9 eV（Au 4f5/2）和84.2 eV（Au 4f7/2）处显示特征结合能，清楚地确认了Zr-MOF纳米颗粒上金属AuNCs的存在[43]。总之，这些全面的XPS结果为AuNCs有效负载到Zr-MOF基质上同时保持两组分的结构完整性提供了有力证据。X射线衍射（XRD）分析确认了合成材料的结晶性质。Zr-MOF/AuNCs（图2E，a）和Zr-MOF（图2E，b）均显示三个特征衍射峰[31]。AuNCs掺入前后XRD图谱的相似性表明在功能化过程中Zr-MOF结晶框架的优异保留。补充的傅里叶变换红外（FTIR）光谱进一步确认了Zr-MOF/AuNCs的结构完整性（图2F），其显示与Zr-MOF几乎相同的峰。1396 cm⁻¹（芳香C-C伸缩）和1555 cm⁻¹（不对称CO振动）处的特征峰确认了关键官能团的保留，而654 cm⁻¹（μ₃-O伸缩）和771 cm⁻¹（芳香C-H弯曲）处的峰进一步验证了完整框架。值得注意的是，1703 cm⁻¹处归属于-COO伸缩振动的尖锐峰为结构保留提供了额外证据。Zr-MOF/AuNCs和Zr-MOF的FTIR光谱结合XRD结果，有力支持了Zr-MOF/AuNCs的成功合成，且未改变母体MOF的结构和功能性质。结合其他全面表征，这些发现确认了AuNCs有效掺入Zr-MOF上同时保持其结晶性和化学功能性[48]。
【数据】Zr-MOF尺寸：90.3 ± 6.0 nm；AuNCs直径：3.6 ± 0.7 nm；Zr-MOF/AuNCs储备液浓度：0.11 g/mL；金浓度：1918 ppm（0.0019 g/mL）；金质量负载：1.73%；Zeta电位：AuNCs +1.82 mV、NH₂-H2 −14.2 mV、Zr-MOF −22.3 mV、Zr-MOF/AuNCs −12.6 mV、Zr-MOF/AuNCs-DNA −16.3 mV；PL发射：565 nm；XPS：C 1s 288.7/285.9/284.8 eV、Zr 3d 184.6/182.2 eV、Au 4f 87.9/84.2 eV；FTIR：1396、1555、654、771、1703 cm⁻¹；XRD：3个特征衍射峰
3.3 ECL生物传感器的构建
图3A展示了ECL生物传感器的示意图，该传感器构建在修饰有Zr-MOF/AuNCs的电极上，基于DNA互补碱基配对原理。电化学验证通过循环伏安法（CV）在含有5 mM K₃[Fe(CN)₆]、5 mM K₄[Fe(CN)₆]、10 mM PBS缓冲液和0.1 M KCl的电解质中进行。如图3B所示，GCE（曲线a）显示对应于[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻电对的明确氧化还原峰。……
【数据】电解质：5 mM K₃[Fe(CN)₆]、5 mM K₄[Fe(CN)₆]、10 mM PBS、0.1 M KCl；原文未详述其他数值
3.4 实验条件的优化
（原文该部分内容未在节选中完整呈现，仅图表清单中提及图4涉及TEA浓度和孵育时间的系统优化。）
【数据】原文未详述
3.5 ECL生物传感器对aDNA检测的性能评估与稳定性
（原文该部分内容未在节选中完整呈现，仅图表清单中提及图5涉及aDNA浓度从1 fM到1 nM的实时ECL响应、ECL强度与lg(c/M)的校准曲线以及4°C下14天的稳定性评估。）
【数据】aDNA浓度范围：1 fM–1 nM；稳定性评估：4°C、14天；误差棒：SD（n = 3）
3.6 外泌体表征与检测
（原文该部分内容未在节选中完整呈现，仅图表清单中提及图6涉及外泌体TEM表征、纳米流式细胞术的尺寸分布和初始浓度谱以及ECL生物传感器14次连续测量的稳定性评估。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功开发并验证了一种用于外泌体灵敏、特异性检测的ECL生物传感器。该平台的核心创新在于两种互补信号放大策略的协同整合。第一，Zr-MOF/AuNCs纳米复合材料通过富集发光体和促进电子转移增强ECL信号。第二，无酶CHA回路作为基于aDNA的放大器，提供显著信号增益，同时规避了酶法固有的操作复杂性和稳定性限制。优化后的生物传感器展现出优异的分析性能，包括宽线性检测范围和低检测限。重要的是，该平台在生物复杂基质中可靠运行，加标血清样品中良好的回收率和优异的长期稳定性证明了这一点。总体而言，这些特性凸显了该ECL生物传感器在临床肿瘤学中的显著转化潜力，使其成为癌症液体活检中传统外泌体分析方法的快速、稳定和灵敏替代方案。
编译者解读：该研究将Zr-MOF/AuNCs纳米复合材料与无酶CHA回路耦合，思路清晰——MOF富集发光体、CHA放大靶标信号，两者互补。187.4 particles/mL的检测限在ECL外泌体传感器中处于较优水平，且血清加标回收验证了临床转化潜力。不过，CHA回路的背景泄漏和MOF批次间一致性仍是放大体系走向实用化的关键瓶颈。此外，该平台目前依赖适配体识别单一标志物，未来若整合多重标志物识别，有望进一步提升肿瘤溯源能力。
参考来源
期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026
DOI：10.1016/j.snb.2026.140470
作者：Fan Feng
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140470