来源：Cold atmospheric plasma triggers Bacillus subtilis membrane vesicles secretion through SOS-endolysin pathway and iron homeostasis modulation with antipathogen efficacy（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
革兰氏阳性菌膜囊泡（MVs）是天然生物材料，却因厚实细胞壁导致自然产量极低。本研究开发了一种绿色高效的物理策略——冷大气等离子体（CAP），诱导枯草芽孢杆菌高产MVs。CAP处理20秒使MVs颗粒产量提升10.19倍，优于传统超声破碎。CAP产生的酸性胁迫、活性氧氮物种（RONS）与物理放电协同作用，激活SOS应答、内溶素通路与铁代谢调控。CAP MVs保留球形纳米结构与99.96%的蛋白组分，生物安全性良好，且对丁香假单胞菌和禾谷镰刀菌的抗病原活性显著增强。
研究背景
革兰氏阳性菌膜囊泡富含酶、抗菌代谢物和功能蛋白，是细胞间通讯、抗病原防御和物质运输的关键介质。枯草芽孢杆菌（B. subtilis）作为模式革兰氏阳性菌和广泛使用的益生菌/植物生防菌，其MVs因天然生物安全性、热稳定性和多样生物活性，在生物医学、农业和食品安全领域潜力巨大。然而，革兰氏阳性菌厚达20–80 nm的细胞壁构成结构屏障，限制MVs出芽和释放，自然产量极低——这一瓶颈严重制约了B. subtilis MVs的规模化生产与广泛应用。此外，革兰氏阳性菌MVs的生物发生机制尚不完全清楚，其在病原控制和细菌胁迫响应中的功能多样性也有待深入探索。现有增强MVs产量的策略包括基因改造、化学诱导和环境胁迫。基因改造策略包括敲除调控细胞壁稳态的基因（如金黄色葡萄球菌中的asp23）和过表达参与宿主细胞裂解系统或囊泡分泌级联的基因（如PBSX内溶素）等。
研究方法
2.1 等离子体实验装置
参照已有方法构建定制大气压等离子体系统，以研究水界面处的空气放电现象（图2A）。实验装置由放电反应器和高压（HV）电源组成。不锈钢针电极和平面电极固定在尺寸为180 mm × 20 mm × 10 mm的玻璃容器中。高压针电极位于水面上方3 mm处，接地平面电极位于玻璃容器底部。向玻璃容器中加入12.5 mL水，深度为7 mm。通过向蒸馏水中添加硫酸钠（Na2SO4，纯度：99%，Kermel，中国）改变水的电导率。溶液电导率为400 μS/cm。玻璃容器浸入维持于4 °C的水浴中。
【数据】反应器尺寸：180 mm × 20 mm × 10 mm；针电极高度：水面上方3 mm；水体积：12.5 mL；水深：7 mm；电导率：400 μS/cm；Na2SO4纯度：99%；水浴温度：4 °C
2.2 材料
枯草芽孢杆菌（B. subtilis）H28菌株购自中国大连奇威生物科技有限公司。金黄色葡萄球菌（S. aureus）由大连民族大学权春善惠赠。大肠杆菌（E. coli）K12菌株为实验室保存菌株。丁香假单胞菌（P. syringae）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。柑橘溃疡病菌（X. axonopodis pv. citri）购自中国广西田园生化股份有限公司。禾谷镰刀菌（F. graminearum）由中农立华生物科技股份有限公司惠赠。番茄（Solanum lycopersicum）种子由大连理工大学栾雨时惠赠。人真皮成纤维细胞（HDF-a）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
【数据】菌株：B. subtilis H28、S. aureus、E. coli K12、P. syringae、X. axonopodis pv. citri、F. graminearum；细胞：HDF-a；种子：番茄；来源：详见原文
2.3 细菌培养与MVs分离
细菌常规培养于Luria-Bertani（LB）培养基中。将细菌接种于LB培养基中培养8 h。随后更换培养基，继续培养16 h。接下来参照MISEV2023指南提取MVs。培养物于17000g、4 °C离心40 min，收集上清液并用0.22 μm滤膜过滤。滤液于170000g、4 °C离心60 min，弃去上清液。沉淀重悬于1 mL PBS中。病原菌接种于LB培养基中培养16 h。禾谷镰刀菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上于28 °C活化3天。
【数据】培养基：LB、PDA；培养时间：8 h + 16 h（细菌）、16 h（病原菌）、3天（真菌）；离心条件：17000g/4°C/40 min，170000g/4°C/60 min；滤膜孔径：0.22 μm；重悬体积：1 mL PBS；真菌活化温度：28 °C
2.4 CAP介导的细菌MVs分泌调控
对于CAP处理，取对数中期培养物（OD₆₀₀ = 0.7，100 mL）离心（8000 g，4 °C，5 min），重悬于50 mL Na2SO4（400 μS/cm）中。将等体积2× LB培养基直接与CAP处理后的细菌悬液混合，混合物培养16 h（37 °C，200 rpm）。PAW处理采用等离子体活化水（PAW）暴露。对数中期培养物同样离心后，重悬于PAW中处理15 min。将等体积2× LB培养基直接与CAP处理后的细菌悬液混合，混合物培养16 h（37 °C，200 rpm）。
【数据】菌液OD₆₀₀：0.7；菌液体积：100 mL；离心条件：8000g/4°C/5 min；重悬体积：50 mL；电导率：400 μS/cm；复苏条件：37°C/200 rpm/16 h；PAW处理时间：15 min
2.5 MVs密度梯度分级
MVs还采用非连续蔗糖密度梯度离心进行纯化。蔗糖储备液（w/v）配制为以下浓度：10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%。将14 mL超速离心管依次小心叠加2 mL各浓度蔗糖溶液形成梯度。MVs样品预先与2 mL 10%蔗糖混合，小心加载于梯度顶部。使用水平转子于100000 g、4 °C离心16 h。离心后，从梯度中收集7个组分，每组分2 mL。每组转移至新超速离心管，用PBS稀释至12 mL，再次于174900 g、4 °C离心2 h。收集所得MVs沉淀用于下游分析。
【数据】蔗糖浓度梯度：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%；每层体积：2 mL；离心管体积：14 mL；离心条件：100000g/4°C/16 h（水平转子），174900g/4°C/2 h；收集组分数：7；每组体积：2 mL；稀释体积：12 mL
2.6 超声介导的细菌MVs分泌调控
对于超声处理，取对数中期培养物（OD₆₀₀ = 0.7，100 mL）离心（8000 g，4 °C，5 min），重悬于50 mL Na2SO4（400 μS/cm）中。悬液以40%强度、80%占空比超声处理1 min。
【数据】菌液OD₆₀₀：0.7；菌液体积：100 mL；离心条件：8000g/4°C/5 min；重悬体积：50 mL；电导率：400 μS/cm；超声强度：40%；占空比：80%；超声时间：1 min
2.7 细菌存活率
将处理后的细菌悬液梯度稀释并涂布于LB琼脂平板进行活菌计数。培养16 h后，计数培养基上的菌落数。对照组的菌落数设为100%，据此计算CAP处理细菌的存活率。
【数据】培养时间：16 h；对照设定：100%；培养基：LB琼脂
2.8 MVs表征
MVs表面形态使用透射电子显微镜（TEM，HT7700 EXALENS，日本）表征。取20 μL样品置于铜网表面，静置5 min，用滤纸吸去多余液体。样品随后用醋酸铀（Electron Microscopy Sciences，美国）染色两次。通过比较不同放大倍数下的图像，进行TEM成像以检查MVs的表面形态和圆度。MVs浓度和尺寸使用纳米颗粒跟踪分析（U30E，NanoFCM，中国）表征。样品经0.22 μm滤膜过滤。每个样品测量三次。MVs蛋白浓度使用BCA蛋白检测试剂盒（T9300A，Takara，中国）定量。样品使用10% SDS-PAGE分析，并用快速银染试剂盒（P0017s，碧云天，中国）显色。MVs脂磷壁酸（LTA）使用细菌脂磷壁酸ELISA检测试剂盒（DM-QT46759，Dumabio，中国）测定。流体力学尺寸分布、PDI和zeta电位通过动态光散射（DLS）测定。
【数据】TEM样品体积：20 μL；静置时间：5 min；染色：醋酸铀，2次；NTA过滤孔径：0.22 μm；测量次数：3次；SDS-PAGE浓度：10%；试剂盒：BCA T9300A、银染P0017s、LTA ELISA DM-QT46759
2.9 活性化学物种定量
H2O2、NO2−和NO3−浓度的测定方法已在先前研究中描述。将氨基磺酸镍与PAW混合，使用UV/VIS分光光度计（TU-1950，Persee，中国）在219 nm处定量NO3−浓度。为定量NO2−浓度，向PAW中加入磺胺溶液作为重氮化试剂和N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐作为偶联试剂，使用UV/VIS分光光度计在540 nm处检测吸光度。PAW中H2O2浓度通过硫酸钛法测定，并通过叠氮化钠消除亚硝酸盐对酸性溶液中H2O2浓度的影响。pH和ORP使用pH和ORP计（MP521，三信，中国）测量。
【数据】NO3−检测波长：219 nm；NO2−检测波长：540 nm；仪器：UV/VIS TU-1950、pH/ORP计MP521；试剂：氨基磺酸镍、磺胺、N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐、硫酸钛、叠氮化钠
2.10 物理化学因素探究
对于H2SO4处理，取对数中期培养物（OD₆₀₀ = 0.7，100 mL）离心（8000 g，4 °C，5 min），重悬于pH = 3的50 mL Na2SO4（400 μS/cm）中。对于放电处理，取对数中期培养物（OD₆₀₀ = 0.7，100 mL）离心（8000 g，4 °C，5 min），重悬于50 mL Na2SO4（400 μS/cm）中。悬液用同等强度的相同电场处理，随后用LB培养基复苏（37 °C，200 rpm，16 h）。对于ROS清除剂处理，向细菌Na2SO4悬液中加入N-乙酰半胱氨酸（NAC，HR8848，百奥莱博，中国）后进行CAP 20 s处理。对于pH中和实验，将PAW处理10 s的溶液用NaOH调节至pH = 7。
【数据】菌液OD₆₀₀：0.7；菌液体积：100 mL；离心条件：8000g/4°C/5 min；H2SO4处理pH：3；重悬体积：50 mL；电导率：400 μS/cm；复苏条件：37°C/200 rpm/16 h；NAC货号：HR8848；PAW处理时间：10 s；中和pH：7
2.11 扫描电子显微镜
对于SEM成像，培养的细菌样品以12000 rpm离心2 min，随后重悬于PBS中。样品离心沉淀后，在含2.5%戊二醛（GA）的PBS中于4 °C固定过夜。洗涤后，将固定后的细菌样品点样于硅片上。待硅片完全干燥后，样品用蒸馏水稀释的梯度乙醇系列（30%、50%、70%、80%、90%和100% v/v）脱水，每步20 min，重复两次。脱水后的样品干燥过夜，成像前镀铂。SEM图像使用扫描电子显微镜获得。
【数据】离心条件：12000 rpm/2 min；固定液：2.5%戊二醛/PBS；固定条件：4°C过夜；乙醇梯度：30%、50%、70%、80%、90%、100%；每步时间：20 min，2次；镀膜：铂
2.12 蛋白质组学分析
对对照组和CAP 20 s处理的B. subtilis进行蛋白质组学分析（图4）。收集细菌样品，经蛋白提取、胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析。差异表达蛋白通过亚细胞定位分析和KEGG通路富集分析进行功能注释。
【数据】处理条件：CAP 20 s；方法：LC-MS/MS；分析：亚细胞定位、KEGG通路富集；原文未详述具体蛋白提取与消化参数
2.13 MVs蛋白质组学分析
对CON MVs和CAP MVs进行蛋白质组学分析（图6）。MVs样品经蛋白提取、胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析。差异表达蛋白通过KEGG通路富集分析进行功能注释。
【数据】样品：CON MVs、CAP MVs；方法：LC-MS/MS；分析：KEGG通路富集；原文未详述具体蛋白提取与消化参数
2.14 细胞毒性 assay
使用CCK-8细胞毒性检测试剂盒评估MVs在哺乳动物细胞中的生物安全性（图5A）。HDF-a细胞以一定密度接种于96孔板中，培养过夜。加入浓度为0、40、80和120 μg/mL的CON-MVs或CAP-MVs，处理48 h。随后加入CCK-8试剂，测定450 nm处吸光度。
【数据】细胞：HDF-a；MVs浓度：0、40、80、120 μg/mL；处理时间：48 h；检测方法：CCK-8；检测波长：450 nm
2.15 植物安全性评估
评估MVs在植物中的生物安全性（图5B）。番茄种子经消毒后置于含不同浓度MVs的培养基中萌发，观察种子萌发率和幼苗生长情况。
【数据】植物：番茄；处理：不同浓度MVs；指标：萌发率、幼苗生长；原文未详述具体浓度与培养条件
2.16 抗病原活性测定
将CON MVs和CAP MVs与病原微生物共培养，评估其抗病原活性（图7）。病原微生物包括X. axonopodis pv. citri、S. aureus和F. graminearum。将DID染色的MVs与病原微生物孵育，观察MVs的摄取情况。
【数据】病原微生物：X. axonopodis pv. citri、S. aureus、F. graminearum；MVs染色：DID；原文未详述具体孵育时间与浓度
研究结果
3.1 CAP介导的B. subtilis MVs生物发生增强及处理条件优化
CAP首先作为一种无化学残留的物理策略应用于高效提升革兰氏阳性菌B. subtilis的MVs生物发生，MVs产量与CAP处理时间呈强正相关（图1A）。最佳处理条件确定为CAP暴露20 s，相较于未处理对照，MVs颗粒产量提升10.19倍，MVs蛋白产量提升9.30倍（图1B、C）。10 s CAP处理也显著促进MVs产生，颗粒和蛋白产量分别提升4.47倍和4.23倍（图1B、C）。然而，延长CAP暴露（≥30 s）导致细菌存活率急剧下降（30 s时低于10%），随后MVs产量降低（图1B、C、D，表S3）。为进一步验证分离MVs的纯度，在超速离心后采用蔗糖密度梯度离心作为额外纯化步骤。纯化的MVs组分通过NTA表征，确认CAP处理的B. subtilis即使经过密度梯度纯化后仍产生显著多于对照的MVs，CAP MVs的颗粒和蛋白浓度分别比对照MVs（CON MVs）高8.55倍和9.55倍，与基于超速离心的结果一致（图S1）。值得注意的是，CAP处理的MVs生产效率显著优于传统超声破碎方法（1 min处理），后者是常用的物理囊泡提取策略（图1B、C），凸显CAP作为B. subtilis MVs生物发生的新型高效诱导剂。由于B. subtilis MVs产量在CAP 20 s时最高，选择该条件进行进一步表征。透射电子显微镜（TEM）确认了保守的球形形态（图1E）以及对照和处理MVs之间一致的尺寸（图1F）。脂磷壁酸（LTA）是根据MISEV2023指南推荐的革兰氏阳性菌囊泡表面标志物，通过ELISA检测。结果表明CON MVs和CAP MVs均含有LTA，而大肠杆菌（E. coli，革兰氏阴性）的外膜囊泡（OMVs）不含LTA，进一步验证了MVs的来源和囊泡身份（图S2A）。Zeta电位测量显示CON MVs为−17.26 mV，CAP MVs为−16.64 mV，表明相似的表面电荷特征（图S2B）。同时，纳米颗粒跟踪分析（NTA）也显示MVs具有相同的尺寸分布特征（图S3）。动态光散射（DLS）测量显示CON MVs的流体力学直径为102.83 nm，CAP MVs为111.67 nm，多分散指数（PDI）分别为0.21和0.24（图S2C）。两个PDI值均低于0.3，表明可接受的尺寸均匀性。在两个独立的CAP处理批次中评估了批间重现性，平均直径的批间变异系数为0.53%，颗粒浓度增强一致（图S4）。蛋白银染显示CAP MVs中众多蛋白表达增强（图1G）。为评估CAP促进的MVs生产方法是否适用于其他细菌，我们测试了CAP诱导金黄色葡萄球菌（S. aureus，革兰氏阳性）和大肠杆菌的MVs生产。CAP处理0、10、20和30 s后，S. aureus MVs产量在30 s CAP处理时颗粒数增加3.70倍，存活率为37.06%（图S5A）。大肠杆菌外膜囊泡（OMVs）产量在30 s CAP处理时也显著增加（图S5B）。大肠杆菌的外膜提供了天然的出芽表面，CAP处理进一步放大了这一过程。这些结果表明，CAP促进的MVs生产方法适用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，尽管增强幅度和潜在生物物理机制可能因细胞壁结构而异。
【数据】最佳CAP处理时间：20 s；MVs颗粒产量提升：10.19倍；MVs蛋白产量提升：9.30倍；10 s CAP颗粒提升：4.47倍；10 s CAP蛋白提升：4.23倍；30 s存活率：<10%；密度梯度纯化后CAP MVs颗粒提升：8.55倍；蛋白提升：9.55倍；超声处理时间：1 min；Zeta电位：CON MVs −17.26 mV，CAP MVs −16.64 mV；DLS直径：CON MVs 102.83 nm，CAP MVs 111.67 nm；PDI：CON MVs 0.21，CAP MVs 0.24；批间CV：0.53%；S. aureus MVs提升：3.70倍（30 s）；S. aureus存活率：37.06%
3.2 物理化学因素对CAP诱导MVs产量增强的贡献：酸性环境、物理放电与RONS的协同作用
为阐明CAP介导MVs生物发生的物理化学基础，我们系统表征了CAP放电过程中产生的微环境变化和活性物种，该过程模拟了闪电与水之间的自然相互作用（图2A）。实际放电过程中CAP装置的视觉观察确认了水界面处稳定的等离子体产生（图2B）。CAP活化诱导形成日益酸性的微环境（60 s时pH 3.12，图2C）和高度氧化的微环境（氧化还原电位，ORP在60 s时为236.67 mV；图2D）。此外，CAP产生了复杂的活性氧氮物种（RONS）混合物，根据其持久性分为瞬时和长寿命活性组分（图2E）。鉴于瞬时RONS在活化水中仅存在数秒或数微秒，我们聚焦于四种典型长寿命RONS组分（NO3−、NO2−、H2O2和O3），并在优化放电参数（32 kV，4 °C）下量化了它们在60 s CAP处理期间的浓度动态。NO3−、H2O2和O3随CAP暴露时间线性累积，60 s时分别达到217.42 μM、240.28 μM和650 μM（图2F、H、I）。相反，NO2−浓度在30 s时达到峰值578.44 μM，60 s时降至406.40 μM（图2G），这是由于通过自由基重组转化为过氧亚硝酸盐（ONOO−）（图2E）。此外，我们测量了H2O2的残留浓度。在16 h处理期间，H2O2浓度从0 h的100.44 μM逐渐降至16 h的9.66 μM（图S6）。然而，H2O2在系统中的水平仍高于对照（图S6）。为解卷积关键CAP物理化学组分对MVs产生的单独和协同贡献，我们用不同处理方式处理B. subtilis（图2J）。我们首先通过PAW和扰动实验研究ROS对MVs释放的影响。PAW介导的RONS处理也诱导了强劲的MVs产生，最佳10 s放电PAW导致颗粒和蛋白产量分别增加4.68倍和4.54倍（图2K、L、S7）。RONS处理后的细菌存活率与CAP处理后高度一致（图S8），表明PAW尽管缺乏瞬时RONS组分，仍保留诱导受控细胞胁迫以促进MVs分泌的能力。我们通过补充ROS清除剂进一步探究ROS的作用。当向细菌悬液中加入N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为ROS清除剂进行CAP 20 s处理时，MVs产量相较于单独CAP 20 s显著降低，颗粒和蛋白产量分别降低2.71倍和2.80倍；然而，产量仍高于未处理对照，颗粒和蛋白分别比对照高3.79倍和3.36倍（图S9）。此外，我们通过单独向B. subtilis添加H2O2验证了ROS对MVs释放的贡献。H2O2处理的MVs产量相较于对照，颗粒增加4.63倍，蛋白增加3.50倍（图S10）。这表明ROS对CAP增强的MVs产生有实质性贡献，同时其他因素也发挥作用。为进一步探究酸刺激对MVs释放的影响，我们进行了单独酸处理和pH中和实验。单独酸性处理使MVs颗粒产量适度增加1.85倍，蛋白产量相较于对照无显著变化（图2K、L），这可能是由于单一酸性环境对蛋白稳定性的不利影响以及对厚革兰氏阳性细胞壁的有限损伤。
【数据】pH：60 s时3.12；ORP：60 s时236.67 mV；放电参数：32 kV，4 °C；NO3−：60 s时217.42 μM；H2O2：60 s时240.28 μM；O3：60 s时650 μM；NO2−：30 s峰值578.44 μM，60 s降至406.40 μM；H2O2残留：0 h 100.44 μM，16 h 9.66 μM；PAW最佳处理：10 s；PAW颗粒提升：4.68倍；PAW蛋白提升：4.54倍；NAC+CAP 20 s颗粒降低：2.71倍；蛋白降低：2.80倍；仍高于对照：颗粒3.79倍，蛋白3.36倍；H2O2单独处理：颗粒4.63倍，蛋白3.50倍；酸处理：颗粒1.85倍，蛋白无显著变化
3.3 CAP增强MVs产生的细胞水平机制
为探究CAP增强MVs产生的细胞水平机制，我们通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、荧光检测和荧光共聚焦观察了CAP处理后的B. subtilis细胞变化（图3A）。SEM图像显示，CAP处理导致细菌表面出现明显的形态变化，包括细胞壁/膜损伤和表面起皱（图3B）。TEM图像进一步证实CAP处理引起细胞壁和细胞膜的结构损伤（图3C）。荧光检测和共聚焦观察显示CAP处理后细胞内氧化应激水平升高（图3D、E、F）。
【数据】处理条件：CAP；观察方法：SEM、TEM、荧光检测、荧光共聚焦；原文未详述具体CAP处理时间与荧光探针
3.4 CAP增强MVs产生的分子机制
为揭示CAP增强MVs产生的分子机制，我们对对照组和CAP 20 s处理的B. subtilis进行了蛋白质组学分析（图4）。蛋白质组学分析统计了总蛋白数（图4A），差异表达蛋白的亚细胞定位分析直方图（图4B），以及蛋白质组学分析结果（图4C、D）。结果表明，CAP处理激活了SOS应答、内溶素通路和铁代谢调控作为与MVs释放相关的候选通路。
【数据】处理条件：CAP 20 s；方法：蛋白质组学分析；分析内容：总蛋白数、亚细胞定位、差异表达蛋白；候选通路：SOS应答、内溶素通路、铁代谢调控
3.5 B. subtilis MVs的生物安全性
评估了MVs在哺乳动物细胞中的生物安全性（图5A）。使用CCK-8细胞毒性检测试剂盒评估了CON-MVs和CAP-MVs在浓度为0、40、80和120 μg/mL时48 h内的细胞活力。评估了MVs在植物中的生物安全性（图5B）。
【数据】细胞：哺乳动物细胞；MVs浓度：0、40、80、120 μg/mL；处理时间：48 h；检测方法：CCK-8；植物安全性：评估
3.6 CAP处理的B. subtilis MVs传递胁迫信号并促进MVs分泌
对对照和CAP MVs进行功能蛋白分析（图6A、B、C、D）。统计了总蛋白数（图6A）。在对照和CAP MVs比较中进行蛋白质组学分析（图6B）。CAP MVs富集了与氧化应激响应和细胞壁降解相关的功能蛋白。
【数据】样品：对照MVs、CAP MVs；方法：蛋白质组学分析；分析内容：总蛋白数、差异表达蛋白；富集蛋白：氧化应激响应、细胞壁降解相关
3.7 B. subtilis MVs具有抗细菌和抗真菌特性
评估了MVs对病原微生物的应用（图7A）。病原微生物摄取CON和CAP MVs。将DID染色的MVs与X. axonopodis pv. citri（a）、S. aureus（b）和F. graminearum（c）孵育后观察（图7B）。CON和CAP MVs均对革兰氏阳性/阴性细菌和真菌表现出抗病原活性，CAP MVs对P. syringae和F. graminearum的效力显著增强。
【数据】病原微生物：X. axonopodis pv. citri、S. aureus、F. graminearum；MVs染色：DID；抗病原活性：CON和CAP MVs均具有；CAP MVs增强病原：P. syringae、F. graminearum
讨论与解读
本研究确立了冷大气等离子体（CAP）作为一种绿色高效的物理策略，用于增强枯草芽孢杆菌膜囊泡（MVs）的产生，同时揭示了与CAP诱导MVs生物发生相关的物理化学因素和分子通路（图1、2、3、4）。此外，我们证明了B. subtilis MVs具有信号转导和抗病原功能（图5、6、7）。这些发现为解决革兰氏阳性菌MVs的实际局限性（包括自然产量低和生物发生通路理解不完整）提供了见解和帮助，并扩展了细菌MVs在生物医学和农业中的转化潜力。
限制革兰氏阳性菌MVs应用的核心挑战是其自然分泌量低，这归因于厚肽聚糖细胞壁的结构屏障。现有策略包括基因改造、化学诱导和超声破碎，但受生物安全性担忧、化学残留或对生物活性组分的热损伤所限制，制约了其环境和工业适用性。我们的工作通过证明CAP诱导的胁迫响应不仅实现了MVs颗粒产量10.19倍的提升（图1），还维持了核心蛋白组成（与对照MVs 99.96%重叠）、MVs球形形态（图1、6）和生物安全性（图5），填补了这一空白。
编译者解读：该研究将CAP这一物理手段引入合成生物学胞外囊泡工程，绕开了基因改造的生物安全争议与化学诱导的残留问题。10.19倍的产量提升在革兰氏阳性菌MVs领域具有实用价值，且蛋白组分99.96%保守意味着功能可预测。但CAP设备通量、放大后放电均匀性以及不同菌株的普适性仍是产业化的关键变量。SOS-内溶素-铁稳态三通路并行调控的发现，为后续理性设计高产菌株提供了新靶点。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.179628
DOI: 10.1016/j.cej.2026.179628