甘油增值化用于枯草芽孢杆菌生物投入品生产

📅 2026-09-12 📰 Bioresource Technology Reports 2026-09-30 📂 研究进展 👁 6

来源：Valorization of glycerol for Bacillus subtilis bioinput production（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

可持续生物工艺的需求日益增长，寻找替代碳源成为微生物生物质生产的关键课题。本研究以纯化甘油替代生物柴油副产甘油，以酵母提取物为氮源，通过23因子实验设计评估了甘油（2.5–7.5 g L−1）和酵母提取物（2.0–4.0 g L−1）在12小时 submerged 培养中对枯草芽孢杆菌生长的影响。最高生物量条件为7.5 g L−1甘油与4.0 g L−1酵母提取物，OD₆₀₀达1.42 ± 0.03，活菌数8.80 × 10⁸ CFU mL−1。ATR-FTIR结合化学计量学实现了培养过程的快速监测，预测模型R > 0.995。

研究背景

生物投入品在推动巴西生物经济发展中扮演核心角色，涵盖生物肥料、生物接种剂和生物防治剂等产品。这类产品需求的增长，迫切需要能在经济与环境可持续条件下实现高密度生物质生产的高效微生物工艺。农业工业废弃物的增值化利用由此成为支撑可持续生物工艺开发的关键策略。全球范围内产生大量农业与工业副产品，处置不当会造成环境污染和温室气体排放。小麦、大米、燕麦、黑麦、大麦和黍等谷物副产物因来源充足且营养丰富而尤具吸引力。这些残渣富含碳和营养物质，适合作为微生物发酵过程的底物。在此背景下，甘油作为生物柴油生产的廉价副产物，为枯草芽孢杆菌生物质生产提供了有前景的替代碳源。

研究方法

2.1 微生物与接种物制备

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为本研究的模型微生物。细菌接种物在标准化条件下制备，以确保实验批次间的可重复性。培养物在受控实验室条件下生长，并以2%（v/v）的比例接种至实验培养基中。

【数据】菌株：Bacillus subtilis；接种量：2%（v/v）；培养条件：受控实验室条件；原文未详述具体温度与时间

2.2 培养基组成与制备

培养基仅由纯化甘油（99%）作为碳源、酵母提取物作为氮源和生长因子提供者组成。纯化甘油（Verquímica）作为模型碳源使用，以确保受控且可重复的实验条件，并最大限度减少粗制生物柴油甘油中常见杂质（如甲醇、盐、皂和残留脂肪酸）带来的变异性，这些杂质可能影响微生物生长和代谢响应。未添加额外的无机盐、缓冲液或微量元素。酵母提取物（Synth）由自溶酵母细胞的水溶性组分构成，其特征为氨基氮 >4.5%、总氮 >10.0%、干物质 >94%、氯化钠含量约0.5%，提供细菌生长所需的氨基酸、肽、维生素和矿物质。培养基通过将适量甘油和酵母提取物溶解于蒸馏水中制备，以获得因子设计所需的浓度：甘油2.5–7.5 g L−1（中心点5.0 g L−1），酵母提取物2.0–4.0 g L−1（中心点3.0 g L−1）。培养基初始pH在灭菌前测量，未进行调整。培养基在121 °C下高压灭菌15分钟，冷却至室温后接种。

【数据】碳源：纯化甘油99%（Verquímica）；氮源：酵母提取物（Synth）；甘油浓度：2.5–7.5 g L−1（中心点5.0 g L−1）；酵母提取物浓度：2.0–4.0 g L−1（中心点3.0 g L−1）；灭菌条件：121 °C、15 min；初始pH：未调整；未添加无机盐、缓冲液或微量元素

2.3 实验设计

采用23因子实验设计，使用Chemoface软件（版本1.71）。甘油和酵母提取物浓度被定义为独立变量，以评估其对微生物生长的个体效应和交互效应。该实验设计能够系统评估培养基组成对枯草芽孢杆菌在受控条件下培养性能的影响。

【数据】设计类型：23因子实验设计；软件：Chemoface version 1.71；自变量：甘油浓度、酵母提取物浓度

2.4 培养条件

所有培养均在250 mL Erlenmeyer锥形瓶中进行，装液量150 mL培养基（60%填充比）。灭菌冷却后，在无菌条件下以2%（v/v）细菌接种物接种。培养物在37 °C、100 rpm、25 mm轨道振荡直径条件下使用恒温振荡器（Marconi, MA420）培养。所有操作参数在实验间保持恒定，以确保可重复性并允许所测试条件间的可靠比较。

【数据】容器：250 mL Erlenmeyer锥形瓶；装液量：150 mL（60%填充比）；接种量：2%（v/v）；温度：37 °C；转速：100 rpm；振荡直径：25 mm；仪器：Marconi MA420恒温振荡器

2.5 取样与生长测定

在12小时培养期间每2小时采集样品，以监测细菌生长动力学和pH变化。微生物生长通过分光光度法测定600 nm光密度（OD₆₀₀）以及在营养琼脂平板上计数活菌（以每毫升菌落形成单位表示，CFU mL−1）来确定。细胞生长以log转换的CFU值表示，以便适当表征种群动态并比较不同采样时间。每个采样点还测量培养基pH。所有实验使用三个独立生物学重复进行，定义为由独立接种物制备并在相同实验条件下培养的独立培养物。

【数据】取样间隔：每2小时；培养时长：12 h；生长测定方法：OD₆₀₀分光光度法、营养琼脂平板活菌计数（CFU mL−1）；pH测定：每个采样点；生物学重复：3个独立重复

2.6 ATR-FTIR分析

进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，以鉴定不同实验条件下培养的枯草芽孢杆菌无细胞上清液（CFS）中代谢物的特征吸收带。光谱使用PerkinElmer Spectrum 400 FTIR光谱仪采集，配备水平衰减全反射（ATR）附件和Spectrum软件版本6.3.5。样品在4000–650 cm−1光谱范围内分析，分辨率4 cm−1，每个样品4次扫描。

【数据】仪器：PerkinElmer Spectrum 400 FTIR光谱仪；附件：水平ATR；软件：Spectrum version 6.3.5；光谱范围：4000–650 cm−1；分辨率：4 cm−1；扫描次数：4次/样品

2.7 化学计量学分析

数据集（X矩阵）由3351列组成，对应4000至650 cm−1波数范围的归一化吸光度值。行（样品）由105个与光密度和log CFU mL−1测量相关的平均光谱，以及63个与pH测量相关的平均光谱组成。平均光谱从每个独立生物学重复采集的光谱三重复中获得。光谱三重复通过振幅（0–1）归一化，随后进行矢量归一化。对每个独立生物学重复获得平均光谱（各波数归一化吸光度值的算术平均值）。ATR-FTIR光谱数据的多变量分析使用化学计量学方法进行，包括主成分分析（PCA），使用Pirouette软件版本4.0（Infometrix）。这些方法能够识别光谱模式以及代谢谱与培养条件之间的相关性。正交投影至潜在结构（OPLS）模型使用一阶导数变换（Savitzky-Goulay，5点）和一个正交校正组分构建，应用全光谱范围。OPLS是一种监督式多变量回归方法，将预测变异与正交（非预测）变异分离，提高模型可解释性并促进与培养条件差异相关变量的识别。对所有构建的模型应用留一法交叉验证，最大潜在变量数（A）根据ASTM E1655-17（2017）确定，该标准定义了防止过拟合的准则（公式(1)）。N ≥ 6A + 1，其中N为样品数（X矩阵行数）。该规则确定可使用而不致过拟合的最大潜在变量数。OPLS模型的性能通过交叉验证均方根误差（RMSECV）和决定系数（R2）评估。

【数据】X矩阵列数：3351；波数范围：4000–650 cm−1；OD/CFU相关平均光谱数：105；pH相关平均光谱数：63；归一化方法：振幅归一化（0–1）+矢量归一化；PCA软件：Pirouette version 4.0（Infometrix）；OPLS变换：一阶导数（Savitzky-Goulay，5点）；正交校正组分：1个；交叉验证方法：留一法；过拟合准则：N ≥ 6A + 1（ASTM E1655-17）；模型评估指标：RMSECV、R2

2.8 微生物生长的数学建模

微生物生长动力学使用Robazza等（2010）提出的两个一阶常微分方程系统描述。公式(2)描述细胞种群随时间的变化：dN(t)/dt = μ(N) N(t)，其中N(t)表示时间t时的微生物种群，μ(N)表示比生长速率。比生长速率作为种群密度的函数的变化由公式(3)描述：dμ(N)/dN(t) = −α · N(t)^m，其中m是与微生物生物学特征相关的参数，α是与环境条件相关的正参数。该模型描述生长速率随种群密度增加而降低，反映营养竞争和抑制性代谢物积累。从数学角度，公式(3)中的负号确保比生长速率的导数随种群密度增加而保持负值，导致生长速率逐渐降低。从概念和数学角度，这种行为反映了负密度依赖原则，其中资源竞争加剧和种群积累相关的抑制效应促进系统自我调节，这是培养条件下生物系统稳定性的基本要求（Jin, 2023; Xu et al., 2025）。

【数据】模型类型：两个一阶常微分方程系统；参数m：与微生物生物学特征相关；参数α：与环境条件相关的正参数；原文未详述具体参数值

2.9 统计分析

所有实验使用三个独立生物学重复（n = 3）进行，结果表示为平均值 ± 标准差（SD）。在推断统计分析前使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性。生长数据（OD₆₀₀和CFU mL−1）和pH值使用双因素方差分析（two-way ANOVA）分析，随后进行Tukey's HSD事后检验。显著性水平设定为95%置信水平（p < 0.05）。

【数据】重复数：n = 3；结果表示：平均值 ± SD；正态性检验：Shapiro–Wilk；统计方法：双因素方差分析 + Tukey's HSD事后检验；显著性水平：p < 0.05

研究结果

3.1 底物效应

Pareto图（图1）显示了甘油浓度（X1）、酵母提取物浓度（X2）及其交互作用（X1 × X2）对枯草芽孢杆菌生物质形成的效应大小。在评估的因素中，甘油与酵母提取物之间的交互作用呈现最高的标准化效应（0.21333），并且是唯一在95%置信水平上具有统计学显著性的参数（p < 0.05）。相比之下，甘油（0.066667）和酵母提取物（0.11）的个体效应未超过显著性阈值。这些结果表明，生物质生产主要受碳源和氮源联合可用性的影响，而非其单独浓度。显著的交互作用表明甘油对微生物生长的效应取决于培养基中酵母提取物的水平，突显了平衡营养组成对优化枯草芽孢杆菌培养性能的重要性。

▲ Standardized Pareto chart showing the effects of glycerol concentration (X1), yeast extract concentration (X2), and their interaction (X1 × X2) on Bacillus subtilis biomass formation under submerged cultivation conditions. Bars represent the absolute values of the estimated effects obtained from the

【数据】甘油标准化效应：0.066667；酵母提取物标准化效应：0.11；交互作用标准化效应：0.21333；显著性：交互作用p < 0.05，个体效应不显著

图2展示了响应面，说明酵母提取物和甘油浓度对枯草芽孢杆菌生长（以营养细胞浓度测量）的影响。X轴和Y轴分别代表酵母提取物和甘油浓度（g L−1），Z轴对应从因子实验设计获得的预测生长响应。随着两种营养物质浓度的增加，生物质形成呈现增加趋势，表明碳源（甘油）和氮源（酵母提取物）之间存在正交互作用。这种行为与碳源和氮源在微生物代谢中的互补作用一致，因为酵母提取物提供细胞生长所需的氨基酸、肽、维生素和矿物质（Gao et al., 2024; Tao et al., 2023）。

▲ Response surface plot showing the combined effects of glycerol and yeast extract concentrations on Bacillus subtilis growth expressed as vegetative cell concentration (log CFU mL−1). The surface was generated from the 23 factorial experimental design using Chemoface software (version 1.71). Experime

【数据】甘油浓度范围：2.5–7.5 g L−1；酵母提取物浓度范围：2.0–4.0 g L−1；趋势：随两种营养物浓度增加生物质形成增加；原文未详述具体预测值

图3显示了在实验条件下培养12小时的枯草芽孢杆菌生长曲线。在前1.5小时观察到延迟期，这是细菌种群调整代谢以适应新环境条件的典型过程（Bate et al., 2023）。随后，在培养4小时内，所有条件均显示活跃的细胞生长，表明进入指数期。该阶段之后是生长速率减速、细胞数轻微额外增加，并在6至7小时之间稳定，标志着向稳定期的过渡。使用7.5 g L−1甘油和4 g L−1酵母提取物的条件（图3a–D），以及5 g L−1甘油和3 g L−1酵母提取物的条件（图3a–E），在实验结束时产生了最高的营养细胞计数（log CFU mL−1）。这种增加的细胞密度表明在这些培养条件下生物质生产增强，反映了培养期间更高的整体代谢性能。然而，根据双因素方差分析及Tukey's HSD事后检验，在营养细胞计数方面，所测试条件之间未观察到统计学显著差异（p > 0.05）。尽管如此，在培养10小时后，使用7.5 g L−1甘油和2 g L−1酵母提取物（图3b-C）以及2.5 g L−1甘油和2 g L−1酵母提取物（图3b-A）培养的OD₆₀₀值较低。这一观察表明所测试的营养组合通常适合枯草芽孢杆菌培养，提供了碳氮可用性之间的适当平衡。Drusilla Wendy等（2022）提到，过量的甘油浓度可能限制代谢过程所需的自由水，诱导渗透胁迫，损害细菌生理。在相同酵母提取物浓度（4.0 g L−1）下，Neves等（2024）报道使用2.5 g L−1蛋白胨培养枯草芽孢杆菌产生8.99 × 10⁸ CFU mL−1。在等效氮补充下，本研究使用7.5 g L−1甘油作为碳源（替代蛋白胨）达到8.80 × 10⁸ CFU mL−1。这些结果证明用甘油替代蛋白胨作为低成本替代底物的可行性，同时保持相当的生物质生产。培养基组成，特别是碳源和氮源之间的平衡，在芽孢杆菌培养中起关键作用，因为营养失衡可能限制生物质合成和微生物性能（Basan et al., 2020）。类似地，Pasotti等（2024）报道含甘油培养基中的发酵性能高度依赖于培养基配方和碳氮比，充足的氮补充对最大化细胞产量至关重要。本研究获得的结果与这些观察一致，并强化了甘油作为枯草芽孢杆菌生物质生产的经济上有吸引力底物的潜力。酵母提取物和蛋白胨是芽孢杆菌培养中最常用的组分，因为它们提供高效微生物生长所需的必需营养（Huang et al., 2023; Malick et al., 2017）。然而，其相对较高的成本可能限制大规模生产过程的经济竞争力。相比之下，甘油是一种廉价且易得的工业副产物，使其成为有吸引力的替代碳源。研究结果表明，甘油可以支持与含蛋白胨培养基报道水平相当的生物质生产，突显其在枯草芽孢杆菌成本有效培养中的潜力。OD₆₀₀测量表明短延迟期后约2小时孵育进入指数生长，表明枯草芽孢杆菌对培养条件的快速适应。5小时后生长稳定表明稳定期开始，可能与营养限制和/或代谢物积累有关。类似的生长动力学已在含甘油培养基中培养的芽孢杆菌属中报道，反映了在不断变化的环境条件下适应和生存所需的生理调整（Basan et al., 2020; Bate et al., 2023; Jaishankar and Srivastava, 2017; Dworkin and Harwood, 2022）。尽管实验在Erlenmeyer规模进行，本研究被构思为甘油增值化用于枯草芽孢杆菌生物质生产的培养基筛选和概念验证方法。本文鉴定的优化配方为后续生物反应器规模研究提供了坚实基础，旨在评估氧传递、过程控制和工业可行性。尽管稳定期细胞通常因其在储存和田间应用中的更强健壮性而成为微生物生物投入品的首选（Sarti et al., 2023），但实现高生物质浓度是开发经济可行生产过程的关键第一步。因此，本研究聚焦于使用甘油作为低成本底物的营养生物质生产的培养基优化。本文鉴定的优化配方为未来生物反应器规模研究以及针对孢子形成、储存稳定性和配方策略的研究提供了基础。

▲ Growth curves of Bacillus subtilis under the experimental design conditions during 12 h of cultivation. (a) Vegetative cell counts; (b) OD₆₀₀. (A) 2.5 g L−1 glycerol and 2 g L−1 yeast extract; (B) 2.5 g L−1 glycerol and 4 g L−1 yeast extract; (C) 7.5 g L−1 glycerol and 2 g L−1 yeast extract; (D) 7.5

【数据】延迟期：前1.5 h；指数期：4 h内；稳定期：6–7 h；最高生物量条件：7.5 g L−1甘油 + 4.0 g L−1酵母提取物（OD₆₀₀ = 1.42 ± 0.03；8.80 × 10⁸ CFU mL−1）；对比文献：Neves等（2024）2.5 g L−1蛋白胨 + 4.0 g L−1酵母提取物 = 8.99 × 10⁸ CFU mL−1；统计显著性：p > 0.05

3.2 pH曲线

总体而言，图4显示不同培养条件在12小时培养期间的pH相似，根据双因素方差分析及Tukey's HSD事后检验，培养条件之间无统计学显著差异（p > 0.05）。这种行为可能与营养消耗和培养基缓冲能力之间的平衡有关，有利于细胞发育的稳定环境。Zhu等（2022）和Pasotti等（2024）在含甘油培养基中培养芽孢杆菌时报道了类似的pH稳定性。此处观察到的稳定性可能与酵母提取物的缓冲效应和营养的平衡可用性有关，有助于维持……

【数据】pH范围：从7.37降至6.46；培养时长：12 h；统计显著性：p > 0.05；原文未详述各条件具体pH值

▲ 不同甘油和酵母提取物浓度培养基中枯草芽孢杆菌培养12小时期间的pH变化曲线。(A) 2.5 g L−1甘油和2 g L−1酵母提取物；(B) 2.5 g L−1甘油和4 g L−1酵母提取物；(C) 7.5 g L−1甘油和2 g L−1酵母提取物

3.3 ATR-FTIR光谱分析

图5显示了不同培养时间和不同酵母提取物与甘油组合下枯草芽孢杆菌培养上清液的ATR-FTIR光谱。光谱分析揭示了与OH、酰胺I/II和CO相关的官能团的时间依赖性变化，表明培养期间的代谢转变。

▲ ATR-FTIR spectra of B. subtilis culture supernatants at different cultivation times and under different yeast extract and glycerol combinations. (A) 2.5 g L−1 of glycerol and 2 g L−1 of yeast extract; (B) 2.5 g L−1 of glycerol and 4 g L−1 of yeast extract; (C) 7.5 g L−1 of glycerol and 2 g L−1 of ye

【数据】光谱范围：4000–650 cm−1；分辨率：4 cm−1；扫描次数：4次/样品；原文未详述具体吸收峰波数值

主成分分析（PCA）得分图（图6）显示，PC1和PC2分别解释总方差的90.28%和6.79%。颜色代表采样时间（0–12h）。椭圆表示聚类……

▲ Principal Component Analysis (PCA) score plot obtained from ATR-FTIR spectra of Bacillus subtilis culture supernatants collected over 12 h of cultivation. PC1 and PC2 explain 90.28% and 6.79% of the total variance, respectively. Colors represent sampling times (0−12h). Ellipses indicate clustering o

【数据】PC1解释方差：90.28%；PC2解释方差：6.79%；采样时间范围：0–12 h

PCA载荷图（图7）显示了光谱变量对前三个主成分（PC1–PC3）的贡献。载荷以波数（4000–950 cm−1）的函数呈现。峰值表示……

▲ PCA loading plots showing the contribution of spectral variables to the first three principal components (PC1–PC3) obtained from ATR-FTIR spectra of Bacillus subtilis culture supernatants. Loadings are presented as a function of wavenumber (4000–950 cm−1). Peaks indicate the spectral regions that mo

【数据】波数范围：4000–950 cm−1；主成分：PC1–PC3；原文未详述具体载荷值

图8显示了ATR-FTIR/OPLS模型中潜在变量（LVs）解释的光谱方差百分比，这些模型针对OD₆₀₀、log CFU mL−1和pH开发。面板显示模型性能：（a）交叉验证均方根误差（RMSECV）和（b）相关系数（R）。校准使用……

▲ Percentage of spectral variance explained by the latent variables (LVs) in ATR-FTIR/OPLS models developed to OD₆₀₀, log CFU mL−1, and pH. Panels show model performance in terms of (a) root mean square error of cross-validation (RMSECV) and (b) correlation coefficient (R). Calibration was performed u

【数据】模型性能：R > 0.995；RMSECV < 0.02；目标参数：OD₆₀₀、log CFU mL−1、pH；原文未详述具体LVs数量

Valorization of glycerol for Bacillus subtilis bioinput prod — ▲ 论文配图

【数据】原文未详述

讨论与解读

本研究证明甘油与酵母提取物组合是枯草芽孢杆菌 submerged 培养生物质生产的实用且具有潜在成本效益的底物。两种营养物之间的交互作用显著影响细胞产量，含7.5 g L−1甘油和4 g L−1酵母提取物的配方在所测试条件中产生最高生物量值，尽管处理间差异未达统计学显著性。这些结果建立了使用低成本碳源高效生成微生物生物质的可重复培养策略。FTIR光谱结合化学计量学工具可有效监测枯草芽孢杆菌培养期间的代谢变化。光谱谱图揭示了与醇类、蛋白质和碳水化合物相关的官能团的时间依赖性变化，PCA能够根据培养基组成和培养时间区分样品。预测性ATR/OPLS模型在实验数据集内显示高预测性能（R > 0.995；低预测误差），表明光谱数据与发酵参数（如OD₆₀₀、log CFU mL−1和pH）之间的强关系。这些发现支持将FTIR结合多变量分析作为监测微生物培养过程的快速、非破坏性方法。从技术角度看，这些结果有助于上游……

编译者解读

该研究以纯化甘油为模型碳源，通过23因子设计验证了甘油替代蛋白胨的可行性，8.80 × 10⁸ CFU mL−1的产量与蛋白胨培养基相当，为生物柴油副产物增值化提供了数据支撑。ATR-FTIR结合OPLS模型（R > 0.995）展示了光谱监测替代传统采样的潜力，但需注意：纯化甘油与粗甘油杂质差异可能影响放大后的代谢响应；实验规模为摇瓶水平，氧传递和pH控制等工程参数尚未验证；孢子形成与储存稳定性未纳入考察。后续研究应以粗甘油为底物，在生物反应器中验证并衔接下游配方工艺。

参考来源

期刊：Bioresource Technology Reports, 2026

DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102887

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