来源：Discovery and pathogenic potential analysis of Pseudomonas monteilii A2: A novel tobacco pathogen（Physiological and Molecular Plant Pathology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
烟草细菌性叶部病害长期威胁产量与品质，而蒙氏假单胞菌（Pseudomonas monteilii）此前仅被报道可感染柑橘。本研究从湖南郴州桂阳县田间典型病叶中分离到菌株A2，通过针刺接种完成柯赫氏法则验证，结合系统发育、ANI与dDDH分析将其鉴定为蒙氏假单胞菌。全基因组测序揭示A2携带丰富的代谢调控、环境适应与毒力相关基因，并呈现"结构—代谢—调控"复合致病网络特征。这是首个被证实对烟草致病的蒙氏假单胞菌分离株，扩展了该物种的已知寄主范围。
研究背景
烟草细菌性叶部病害——如野火病和角斑病——是制约烟叶产量与品质的主要生物因素。这类病害引起水渍状病斑、褪绿、坏死和早衰，压缩有效光合面积，造成产量与商品价值同步损失。感染还会改变叶面微生态与内部化学成分，损害烘烤特性与工业可用性，带来进一步经济损失。
假单胞菌属为革兰氏阴性杆状菌，兼性腐生。其中恶臭假单胞菌（P. putida）既是人类机会致病菌，也是环境污染指示菌和植物病原菌。蒙氏假单胞菌细胞大小约0.7–0.8 × 1.5–2.0 μm，与恶臭假单胞菌系统发育关系密切，生态功能多样：曾从术后菌血症患者血液、支气管扩张患者痰液、脑膜炎病例脑脊液及腹腔引流液中分离；同时能促进浮萍等水生植物生长、降解苯酚和对硝基苯酚、吸附镉和锌，具备生物修复潜力。但其植物致病性此前仅在柑橘中被观察到。本研究从烟草病叶中分离获得一株蒙氏假单胞菌，旨在明确其分类地位与致病潜力。
研究方法
2.1 菌株分离与分子鉴定
从烟草叶片上切取典型病斑（褐色、带黄色晕圈）。在层流超净工作台中进行表面消毒：先用无菌水冲洗，再用75%乙醇处理一次，随后用无菌水冲洗两次。将消毒后的叶组织研磨成匀浆，按10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴和10⁻⁵进行梯度稀释。每个稀释度取100 μL涂布于LB琼脂平板（三次重复），28°C培养24小时。挑取单菌落纯化后，在LB液体培养基中于28°C摇床培养24小时。将纯化菌株涂布于LB固体培养基，28°C培养24小时观察菌落形态。使用Gram Staining Kit（Hopebiol）进行革兰氏染色，1000×显微镜下观察。取500 μL培养物用OMEGA DNA提取试剂盒提取基因组DNA，进行16S rDNA PCR和全基因组测序以完成初步鉴定。
【数据】消毒剂：75%乙醇；稀释梯度：10⁻¹至10⁻⁵；涂布体积：100 μL；培养基：LB琼脂/LB液体；温度：28°C；时间：24 h；染色试剂盒：Hopebiol；DNA提取体积：500 μL
2.2 致病性测定
将纯培养物在LB液体培养基中于28°C培养24小时。采用针刺接种法，将10 μL细菌悬液（OD600 = 0.5）接种至健康烟草叶片背面以评估致病性。接种植株在30°C、80%相对湿度条件下培养，随后从发病组织重新分离病原菌以完成柯赫氏法则验证。
【数据】接种体积：10 μL；菌液浓度：OD600 = 0.5；培养温度：30°C；相对湿度：80%；培养时间：原文未详述
2.3 全基因组测序
取致病菌株的高质量基因组DNA，构建Illumina（300–500 bp）和PacBio Sequel（10–20 kb）测序文库。Illumina原始reads使用FastQC和Trimmomatic进行质量修剪；保留长度≥500 bp且质量分数≥0.8的PacBio subreads用于组装。
【数据】Illumina文库插入片段：300–500 bp；PacBio文库插入片段：10–20 kb；PacBio reads长度阈值：≥500 bp；质量分数阈值：≥0.8
2.4 全基因组组装
Illumina reads用ABySS v2.0.2预组装；通过BLASTR比对PacBio reads填补缺口。校正后的PacBio reads使用CANU v1.7组装，用Illumina短读长数据polish以提高准确性，再用GapCloser v1.12补gap，获得高精度基因组。
【数据】组装软件：ABySS v2.0.2、CANU v1.7；补gap软件：GapCloser v1.12；比对工具：BLASTR；polish数据：Illumina短读长
2.5 基因预测与功能注释
使用Circos v0.69-8对完整基因组进行可视化展示。蛋白编码基因用GeneMark预测；rRNA和tRNA基因分别用RNAmmer v1.2和tRNAscan-SE v1.3.1鉴定。预测蛋白通过BLAST + v2.7.1比对NCBI非冗余蛋白（NR）、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库进行功能注释。毒力因子、碳水化合物活性酶和宿主互作蛋白通过BLASTN v2.2.26（E ≤ 1e-5）分别比对毒力因子数据库（VFDB）、碳水化合物活性酶数据库（CAZy）和病原—宿主互作数据库（PHI-base）进行鉴定。
【数据】可视化软件：Circos v0.69-8；基因预测软件：GeneMark；rRNA鉴定：RNAmmer v1.2；tRNA鉴定：tRNAscan-SE v1.3.1；注释工具：BLAST + v2.7.1；数据库比对工具：BLASTN v2.2.26；E值阈值：≤ 1e-5；注释数据库：NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO、VFDB、CAZy、PHI-base
2.6 系统发育分析及ANI与dDDH值计算
菌株16S rRNA基因序列在EzBioCloud数据库中进行相似性分析，以鉴定同属内近缘模式菌株，以Balneatrix alpica DSM 16621作为外群。使用OrthoFinder鉴定单拷贝核心基因，用MAFFT比对后串联。使用IQ-TREE 2以LG + F + I + R6模型和1500次bootstrap重复构建系统发育树。平均核苷酸一致性（ANI）和数字DNA-DNA杂交（dDDH）分别使用pyani和基因组到基因组距离计算器（GGDC）在线平台计算。
【数据】外群：Balneatrix alpica DSM 16621；核心基因鉴定：OrthoFinder；比对工具：MAFFT；建树软件：IQ-TREE 2；模型：LG + F + I + R6；bootstrap重复数：1500；ANI计算：pyani；dDDH计算：GGDC在线平台
2.7 比较基因组分析
从NCBI检索同物种的公开基因组。使用Mauve进行基因组比对以鉴定基因组重排等大规模进化事件；使用OrthoFinder鉴定核心基因和菌株特异性基因；使用MAFFT进行多序列比对。使用MCMCtree估计物种分化时间，以TimeTree数据库中目标物种与Balneatrix alpica之间的化石分化时间作为校准点。基于OrthoFinder预测的基因家族构建的系统发育树和估计的物种分化时间，使用CAFE 5分析基因家族扩张/收缩，并使用eggNOG-mapper v2.1.12比对eggNOG v5.0数据库对显著改变的基因家族进行功能分类。
【数据】基因组比对软件：Mauve；基因家族分析：OrthoFinder；多序列比对：MAFFT；分化时间估计：MCMCtree；校准数据库：TimeTree；基因家族扩张/收缩分析：CAFE 5；功能分类：eggNOG-mapper v2.1.12；功能数据库：eggNOG v5.0
研究结果
3.1 病原菌的分离与初步鉴定
在中国湖南省郴州市桂阳县（地理坐标：东经112°13′26″–112°55′46″，北纬25°27′15″–26°13′30″）进行田间调查时，选取呈现典型症状——圆形或近圆形、褐色、水渍状病斑并带有明显黄色晕圈——的烟草叶片进行细菌分离。基于菌落形态和16S rRNA测序，筛选出分离株A2，鉴定其属于假单胞菌属。
【数据】采样地点：湖南省郴州市桂阳县；经度：112°13′26″–112°55′46″E；纬度：25°27′15″–26°13′30″N；病斑特征：圆形或近圆形、褐色、水渍状、黄色晕圈；分离株编号：A2
3.2 致病性与表型特征分析
在受控条件下对分离株A2进行致病性测试。采用针刺法将A2接种至健康烟草叶片，以无菌水作为阴性对照。在28°C高湿条件下培养5天后，接种A2的叶片出现褐色病斑并环绕明显黄色晕圈（图1B），与田间症状一致，而对照叶片无症状（图1A）。从发病叶片重新分离获得的细菌与原接种菌一致，完成柯赫氏法则验证，确认A2为烟草病原菌。在LB固体培养基上，A2形成圆形、灰白色、光滑、隆起、半透明的菌落（图1C）。革兰氏染色显示红色菌体，表明A2为革兰氏阴性（图1D）。
【数据】接种方法：针刺法；接种量：10 μL（OD600 = 0.5，见方法2.2）；培养温度：28°C；培养湿度：高湿；观察时间：5天；菌落形态：圆形、灰白色、光滑、隆起、半透明；革兰氏染色：红色（阴性）；对照：无菌水
3.3 分离株A2的Illumina双端测序与PacBio测序
为获得分离株A2的高质量基因组序列，将Illumina HiSeq双端reads与PacBio长reads整合分析。Illumina测序产生2555 Mb原始数据（17,034,480条reads），经接头修剪和质量过滤后获得2516 Mb clean data（16,822,198条reads）。PacBio测序产生29,328条过滤后reads，平均长度6582 bp，主要分布在5000–10,000 bp之间，有效弥补了Illumina短读长在重复序列区域覆盖不足的问题。两个平台的详细测序统计汇总于表1。
【数据】Illumina原始数据：2555 Mb（17,034,480 reads）；Illumina clean data：2516 Mb（16,822,198 reads）；PacBio过滤reads：29,328条；PacBio平均读长：6582 bp；PacBio读长主要分布：5000–10,000 bp
3.4 A2基因组组装与注释
通过Illumina和PacBio测序reads的联合组装，获得一条跨度为5,674,770 bp的单一环状染色体，GC含量为61.66%。基因预测鉴定出5168个编码序列（CDSs）（总长度5,018,799 bp）、76个tRNA基因和22个rRNA基因（包括8个5S rRNA、7个16S rRNA和7个23S rRNA）（表1，图2A）。功能注释将全部5168个基因分配至至少一个公共数据库：5070个（NR）、3597个（GO）、4347个（COG）、2821个（KEGG）和3344个（Swiss-Prot）。其中2370个基因（45.9%）同时在五个数据库中被注释（图2B）。COG分类（图2C）将4347个基因归入21个功能类别：未知功能（16.2%）、氨基酸转运/代谢（10.8%）、转录（10.4%）和细胞壁/膜/胞外结构（7.0%）；RNA加工/修饰基因最少（n = 1）。KEGG映射（图2D）将2821个基因分配至前20条通路：代谢（26.6%）、次级代谢产物生物合成（11.3%）和不同环境中的微生物代谢（8.7%），表明A2具有广泛的代谢潜力和较强的环境适应性。GO注释（图2E）将A2中3597个基因分类为生物过程、分子功能和细胞组分，其中大多数与细胞、组织和生物体过程、膜结合及催化活性相关。
【数据】染色体长度：5,674,770 bp；GC含量：61.66%；CDSs：5168个（总长5,018,799 bp）；tRNA基因：76个；rRNA基因：22个（8个5S、7个16S、7个23S）；NR注释：5070个；GO注释：3597个；COG注释：4347个；KEGG注释：2821个；Swiss-Prot注释：3344个；五库共注释：2370个（45.9%）；COG未知功能：16.2%；氨基酸转运/代谢：10.8%；转录：10.4%；细胞壁/膜/胞外结构：7.0%；RNA加工/修饰：n = 1；KEGG代谢：26.6%；次级代谢产物生物合成：11.3%；不同环境微生物代谢：8.7%
3.5 系统发育分析与物种界定
将A2的16S rRNA基因序列提交至EzBioCloud数据库进行比对，包含35株假单胞菌模式菌株和13株蒙氏假单胞菌，以Balneatrix alpica DSM 16621为外群。鉴定出的806个单拷贝核心基因经比对串联后构建系统发育树。结果显示A2聚类于蒙氏假单胞菌分支内，与其他假单胞菌物种明显分离（图3A）。ANI和dDDH分析均支持该分类：A2与蒙氏假单胞菌菌株之间的ANI值为96.6%–99.7%（≥95%物种界定阈值），dDDH值为71.2%–97.7%（≥70%物种水平 cutoff）（图3B和C）。相比之下，其他假单胞菌物种的ANI和dDDH值显著低于这些阈值（分别为82.1%–91.5%和19.2%–44.7%）。先前研究表明，P. kurunegalensis与P. monteilii在核心—泛基因组分析中聚类于同一Clique_3亚群，Mash距离仅为0.04（≤0.05物种水平 cutoff）。本研究中P. kurunegalensis RW1P2ᵀ也聚类于蒙氏假单胞菌分支内（ANI = 96.7%，dDDH = 71.4%），与先前发现一致。这意味着两个分类单元在基因组水平上可能构成单一基因种，提示分类边界模糊或同物异名问题尚未解决。总之，系统基因组学和化学分类学数据共同确认分离株A2为蒙氏假单胞菌。
【数据】比对模式菌株：35株假单胞菌 + 13株蒙氏假单胞菌；外群：Balneatrix alpica DSM 16621；单拷贝核心基因：806个；A2与蒙氏假单胞菌ANI：96.6%–99.7%；dDDH：71.2%–97.7%；其他假单胞菌ANI：82.1%–91.5%；其他假单胞菌dDDH：19.2%–44.7%；P. kurunegalensis RW1P2ᵀ ANI：96.7%；dDDH：71.4%；Mash距离：0.04
3.6 A2的共线性分析与基因组进化
将A2基因组与另外13株蒙氏假单胞菌进行Mauve比对，揭示广泛的共线性保守。A2与4株菌（B5、L2757hy、NMI8712 11、NMI10873 11；图4Aa–d）呈现近乎完美的共线性，而与另外3株（NMI6266 12、NMI135_16、NMI985 06；图4Ae–g）仅观察到单一重排。相比之下，6株菌（170918607、DSM 14164 T、PSE11、FDAARGOS 171、STW0522 72、TCU CK1；图4Ah–m）显示多重重排和倒位，表明进化过程中发生了大量基因组重构。核心基因系统发育和物种分化时间估计将A2与8株近缘菌（排除6株更早分化的菌株）的共同祖先的分化时间定位于54.23至347.87百万年之间（图4B）。CAFE分析鉴定出A2中23个基因家族扩张和81个收缩，其中4个扩张和5个收缩具有统计学显著性（表2）。显著扩张的包括乙酰转移酶、磷酸丝氨酸N-乙酰转移酶相关蛋白、维生素B12生物合成酶和DNA解旋酶——这些功能与DNA修复、基因组稳定性、翻译后蛋白修饰和代谢调控相关。这些扩张可能增强A2在多样环境条件下的适应能力。显著收缩涉及双组分重金属响应转录调控因子（COG0745）、von Willebrand因子A结构域蛋白、UPF0758家族成员、RND外排系统相关外膜脂蛋白NodT（COG1538）和多铜氧化还原酶。这些收缩的基因家族主要与环境感知、金属稳态、转运功能和氧化应激响应相关。COG0745的收缩可能表明在相对稳定的宿主相关环境中对广谱重金属胁迫感知的依赖性降低，而COG1538相关NodT蛋白的减少可能反映外排功能的选择性优化而非转运能力的完全丧失。类似地，多铜氧化还原酶相关家族的收缩可能代表适应宿主相关氧化条件过程中精细化的氧化还原调控策略。总体而言，这些变化表明A2经历了基因组水平的功能精简，在环境多功能性与对烟草宿主生态位的特化适应之间取得平衡。
【数据】比较菌株数：13株蒙氏假单胞菌；近乎完美共线性：4株（B5、L2757hy、NMI8712 11、NMI10873 11）；单一重排：3株（NMI6266 12、NMI135_16、NMI985 06）；多重重排/倒位：6株（170918607、DSM 14164 T、PSE11、FDAARGOS 171、STW0522 72、TCU CK1）；分化时间：54.23–347.87百万年；基因家族扩张：23个；收缩：81个；显著扩张：4个；显著收缩：5个；显著扩张家族：乙酰转移酶、磷酸丝氨酸N-乙酰转移酶相关蛋白、维生素B12生物合成酶、DNA解旋酶；显著收缩家族：COG0745、von Willebrand因子A结构域蛋白、UPF0758家族、COG1538（NodT）、多铜氧化还原酶
3.7 A2的核心候选毒力基因
为进一步鉴定A2致病性的核心驱动因子，对VFDB、PHI-base和CAZy注释进行了跨数据库比较（图5；表3；补充表1）。VFDB加PHI-base：21个共享基因同时具有毒力因子属性和宿主互作表型：（i）黏附与生物膜形成：DNA/RNA结合调控因子（uvrY、rpoE、CHR29_RS27445），上游调控鞭毛……
【数据】跨库比较数据库：VFDB、PHI-base、CAZy；VFDB+PHI-base共享基因：21个；黏附与生物膜形成相关基因：uvrY、rpoE、CHR29_RS27445
讨论与解读
蒙氏假单胞菌通常被视为人类机会致病菌，但零星报道提示其具有植物致病潜力。本研究从典型烟草叶片病斑中分离到A2，形态学、系统发育、ANI和dDDH分析一致将其归入蒙氏假单胞菌，扩展了该物种的已知寄主范围。植物病原细菌研究已从单一毒力因子转向系统层面理解，强调运动性、趋化性、生物膜形成和多种分泌系统在宿主微环境中的协同作用。本研究整合VFDB/PHI-base/CAZy的分析证实，A2的致病性由"结构—代谢—调控"网络驱动，而非单一决定因子。病原菌毒力表达通常受环境信号和宿主因子动态调控。A2基因组携带广泛的代谢、信息处理和信号转导功能模块，表明其具有强大的代谢调控能力和环境适应潜力。部分与环境感知和调控相关的双组分系统呈现收缩或结构精细调整，提示A2在长期宿主适应过程中经历了基因组水平的功能优化。
编译者解读：该研究以"分离—回接—测序—比较基因组"的经典路径，首次将蒙氏假单胞菌的寄主范围拓展至烟草，方法链条完整、证据层级清晰。其价值在于提示：环境修复菌与机会致病菌之间的界限可能比预想更模糊，同一物种在不同宿主语境下可展现截然不同的致病策略。局限也明显——基因家族扩张/收缩与致病性的因果关联尚未通过基因敲除或回补实验验证，waaF等关键节点的功能贡献仍停留在注释层面。对合成生物学而言，A2的"结构—代谢—调控"网络可作为底盘改造的靶点库，但需先厘清哪些模块真正驱动致病、哪些仅为适应性状。
参考来源
期刊：Physiological and Molecular Plant Pathology, 2026
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103475
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103475