来源：Heterologous expression and enzymatic properties of the urate oxidase gene from Aspergillus cristatus（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
高尿酸血症影响全球超千万人，而人类在进化过程中尿酸氧化酶（UOX）基因已失活，需依赖外源酶治疗。本研究首次从冠突曲霉（Aspergillus cristatus）中克隆UOX基因，经密码子优化后在E. coli BL21(DE3)中异源表达，并通过多步结构导向策略获得五个突变体。其中Y243K突变体比活力达野生型的2.75倍，与底物结合亲和力更强，且在尿素处理下活性保留率提高20%。分子动力学模拟揭示了其稳定性增强的结构机制。
研究背景
尿酸是嘌呤代谢的终产物，约三分之二经肾脏排泄，其余通过肠道排出。正常情况下尿酸生成与排泄维持动态平衡，但生成过多或排泄不足会导致血清尿酸升高，引发高尿酸血症，全球受影响人数超过一千万且患病率持续上升。高尿酸水平与高血压、卒中、心力衰竭、恶性肿瘤、冠心病、慢性阻塞性肺病及代谢综合征等多种急慢性疾病密切相关。
尿酸氧化酶（UOX，EC 1.7.3.3）能催化尿酸降解为可溶性尿囊素，是降低尿酸水平的有效治疗策略。然而在人类进化过程中，UOX编码基因发生突变，其活性逐步下降并最终丧失功能，因此高尿酸血症患者需要外源UOX补充治疗。重组UOX已获FDA批准用于临床高尿酸血症和肿瘤溶解综合征的治疗，但现有产品如拉布立酶仍受限于半衰期短和免疫原性高等问题——后者可引发过敏反应或被抗体中和，降低疗效。此外，UOX稳定性差也严重制约其实际应用。从系统发育多样的微生物资源中挖掘具有优良特性的新型UOX，成为解决上述瓶颈的重要方向。来自系统发育距离较远物种的蛋白质通常在序列和结构上存在差异，可能影响表面表位等关键免疫原性决定簇，因此广泛筛选微生物来源的UOX是一种合理策略。本研究首次从冠突曲霉中克隆UOX基因，通过异源表达和理性设计提升其催化性能与稳定性。
研究方法
2.1 菌株、质粒与化学试剂
使用pET−28a(+)载体克隆来源于冠突曲霉（GenBank登录号PP126609）的UOX基因（GenBank登录号PX363524）。所得重组质粒由金斯瑞（南京，中国）转化至E. coli Top10中进行扩增。本实验室保存的E. coli BL21(DE3)菌株经重组质粒转化后用于异源表达。限制性内切酶NdeI和BamHI购自Takara（北京，中国）。尿酸、硫酸卡那霉素（Kan）和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）由麦克林（上海，中国）提供。其他所有试剂均购自商业渠道，使用最高可用级别。
【数据】载体：pET−28a(+)；菌株：E. coli Top10、E. coli BL21(DE3)；限制性内切酶：NdeI、BamHI；抗生素：卡那霉素；诱导剂：IPTG；基因登录号：PX363524（UOX）、PP126609（菌株）
2.2 PCR扩增与生物信息学分析
使用生工（上海，中国）的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒从冠突曲霉菌丝体中提取基因组DNA。UOX基因从冠突曲霉全基因组测序数据中鉴定获得，归类于UOX超家族。基于该鉴定序列设计特异性引物进行扩增：UOX-F：5′-TCTGCAGGAGTCCATGCTAT−3′和UOX-R：5′-ACTCAGGATGACCATTGTCG−3′。所有引物由生工（上海，中国）合成，用于PCR扩增及后续测序验证。PCR扩增条件如下：94°C初始变性5 min；30个循环的94°C变性30 s、56°C退火40 s、72°C延伸1 min 30 s；最后72°C终延伸10 min。PCR产物使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化，并用UOX-F和UOX-R引物进行DNA测序验证。将确认的核苷酸序列翻译为对应氨基酸序列，在蛋白质水平进行生物信息学分析。包括通过BLASTP搜索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）确认其身份，并使用MEGA6软件从相关蛋白序列构建系统发育树。此外，使用ExPASy在线工具（http://web.expasy.org/protparam）计算酶的分子量和等电点，利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测其信号肽位点。
【数据】模板：冠突曲霉基因组DNA；引物：UOX-F（5′-TCTGCAGGAGTCCATGCTAT−3′）、UOX-R（5′-ACTCAGGATGACCATTGTCG−3′）；PCR条件：94°C 5 min；（94°C 30 s，56°C 40 s，72°C 1 min 30 s）×30循环；72°C 10 min；软件：BLASTP、MEGA6、ExPASy ProtParam、SignalP 4.1
2.3 基因克隆与定点突变
在初步扩增和测序后，对鉴定出的UOX基因进行大肠杆菌密码子优化，由金斯瑞（南京，中国）合成。优化序列两端修饰了NdeI和BamHI限制性酶切位点，N端融合了6×His标签以便后续蛋白纯化。随后将该合成片段插入pET−28a(+)载体，构建重组质粒pET28a(+)-WT-UOX。定点突变通过同源重组进行。使用含有所需突变的合成DNA片段精确替换pET−28a(+)-WT-UOX质粒骨架中的目标区域。所有构建的重组质粒均经测序验证。
【数据】密码子优化：针对E. coli；标签：N端6×His；限制性位点：NdeI、BamHI；突变方法：同源重组；验证方法：DNA测序；质粒命名：pET28a(+)-WT-UOX
2.4 蛋白表达与纯化
所有重组质粒经序列验证后，将野生型和突变体构建体转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞，获得相应的重组工程菌株。阳性克隆以1%（v/v）接种量接种于含卡那霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani（LB）肉汤中，在37°C、200 rpm条件下培养至光密度（OD₆₀₀）达到0.6–1.0。随后加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L诱导蛋白表达，在37°C下诱导6小时。发酵液在4°C、6000 rpm/min离心20 min。离心收集的菌体用裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4）重悬，然后使用上海维米科技（中国）的WM−450E超声细胞破碎仪进行超声破碎，振幅30%，处理15 min（3 s开、3 s关脉冲循环）。最后，裂解液在8000 rpm离心20 min获得粗酶液，于4°C保存。将20 mL UOX溶液加载到Ni-NTA柱上，用缓冲液I（250 mM NaH₂PO₄，pH 8.0，2.5 mM NaCl）平衡。随后用缓冲液I中的咪唑梯度洗脱。洗脱组分交换至缓冲液II（250 mM NaH₂PO₄，pH 8.0，2.5 mM NaCl，250 mM咪唑）。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估尿酸氧化酶纯度，样品用4×Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，美国）制备，95°C加热后电泳，再用考马斯亮蓝G−250染色。蛋白浓度使用BCA检测试剂盒（天根生化，中国）以牛血清白蛋白为标准品测定[35]。
【数据】培养基：LB（含100 μg/mL卡那霉素）；接种量：1%（v/v）；培养条件：37°C、200 rpm至OD₆₀₀ 0.6–1.0；IPTG浓度：0.5 mmol/L；诱导条件：37°C、6 h；离心：6000 rpm、20 min、4°C；超声条件：振幅30%、15 min、3 s开/3 s关；裂解缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）；二次离心：8000 rpm、20 min；纯化柱：Ni-NTA；缓冲液I：250 mM NaH₂PO₄（pH 8.0）、2.5 mM NaCl；缓冲液II：250 mM NaH₂PO₄（pH 8.0）、2.5 mM NaCl、250 mM咪唑；上样体积：20 mL；SDS-PAGE加热：95°C；染色：考马斯亮蓝G−250；蛋白定量：BCA法
2.5 突变体的理性设计与筛选
五个突变（W162Y、Q189V、N231A、Y243K和Δ269–271）通过多步优先级策略进行理性选择，该策略涉及顺序性的、结构信息指导的过滤过程。首先，ESM-scan算法对所有可能的单点替换进行粗粒度筛选。选择预测为有益或中性效应的残基位点（图S2）。随后，将这些候选位点映射到AlphaFold3预测的野生型结构上，并在底物结合口袋的结构背景下进行评估。在此阶段，优先考虑活性位点附近或参与构象动力学的区域的残基，因为这些被假设为最直接影响催化功能。若干预测得分高但位于结构刚性核心或机制角色不明确的位点因此被排除。最终，基于有利的ESM-scan预测与其底物结合的结构合理性相结合，选择五个突变进行实验表征。
【数据】突变体：W162Y、Q189V、N231A、Y243K、Δ269–271；筛选算法：ESM-scan；结构预测：AlphaFold3；筛选标准：预测效应+底物结合口袋结构相关性
2.6 分子对接
使用AlphaFold3预测蛋白结构[36]。随后，使用Schrödinger软件在其默认参数下进行半柔性对接，以评估前节理性选择的突变。
【数据】结构预测工具：AlphaFold3；对接软件：Schrödinger（默认参数）；对接方式：半柔性对接
2.7 分子动力学模拟
使用GROMACS 2020.3和AMBER14SB力场[37]对复合物进行分子动力学（MD）模拟。配体参数通过https://www.bio2byte.be/acpype/平台生成（原子类型=AMBER；电荷方法=BCC），整合到模拟中。能量最小化程序以最速下降算法50000步开始，过渡到共轭梯度优化，同时对主链原子施加100 kJ/mol/nm的约束以稳定蛋白构象。系统在正则系综（NVT）下以V-rescale温度调节在100 ns内逐渐加热至310 K。随后，使用Berendsen耦合在1 bar下进行三次1 ns压力平衡循环。生产MD模拟包括三次独立的100 ns重复，不施加位置约束。这些模拟采用LINCS氢键约束，通过粒子网格Ewald方法计算长程静电作用，范德华截断值为10 Å。使用2 fs积分时间步长，每10 ps捕获轨迹快照。结合亲和力分析采用MM/PBSA方法，使用gmx_mmpbsa[38]。通过计算分析均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）和氢键形成模式，定量评估结构动力学和系统稳定性[39]。
【数据】软件：GROMACS 2020.3；力场：AMBER14SB；配体参数平台：acpype（原子类型AMBER，电荷BCC）；能量最小化：最速下降50000步+共轭梯度；主链约束：100 kJ/mol/nm；加热：310 K、100 ns、NVT、V-rescale；压力平衡：1 bar、3×1 ns、Berendsen耦合；生产模拟：3×100 ns、无位置约束；氢键约束：LINCS；静电方法：粒子网格Ewald；范德华截断：10 Å；积分步长：2 fs；轨迹快照：每10 ps；结合能方法：MM/PBSA（gmx_mmpbsa）
2.8 酶活性测定
酶活性按文献[40]所述方法评估。反应通过将150 μL预热的……
【数据】反应体积：150 μL；原文在此处节选结束，后续步骤原文未详述
研究结果
3.1 序列分析与尿酸氧化酶基因
冠突曲霉UOX基因确定为921个核苷酸，编码306个氨基酸的蛋白质（图1）。推导的氨基酸序列经ExPASy ProtParam分析，预测理论pI为5.89，分子量约35.0 kDa，N端为甲硫氨酸残基。基于氨基酸序列比对构建的系统发育分析显示，与其他曲霉属菌株中的同源基因具有76%的序列一致性（图S1）。其氨基酸组成中Val（8.5%）、Thr（9.5%）和Leu（7.5%）含量较高，仅含2个Cys（0.7%），提示可能不存在二硫键。蛋白不稳定指数为31.47（<40），脂肪族指数为82.48，亲水性指数（GRAVY）为−0.457，表明结构稳定且溶解性良好。这些生物信息学特征为后续异源表达和功能表征提供了良好基础，此前尚未有关于其酶学性质的报道。
【数据】基因长度：921个核苷酸；氨基酸数：306；理论pI：5.89；分子量：约35.0 kDa；N端残基：甲硫氨酸；序列一致性：76%；Val含量：8.5%；Thr含量：9.5%；Leu含量：7.5%；Cys数量：2（0.7%）；不稳定指数：31.47；脂肪族指数：82.48；GRAVY：−0.457
3.2 候选突变体的鉴定
通过应用第2.5节详述的多步结构导向优先级策略，选择五个突变候选体（W162Y、Q189V、N231A、Y243K和Δ269–271）进行实验表征，该策略强调位于柔性、底物近端区域的残基，而非刚性核心中高预测得分的残基。构建这些变体并评估其对催化效率和稳定性的影响。
【数据】突变体：W162Y、Q189V、N231A、Y243K、Δ269–271；筛选策略：多步结构导向优先级
3.3 重组载体构建与蛋白纯化
从冠突曲霉基因组DNA中扩增天然UOX基因，经大肠杆菌密码子优化后克隆至pET−28a(+)载体，获得表达构建体pET−28a(+)-WT-UOX（图2A、B）。从E. coli TOP10细胞中提取携带野生型UOX基因和五个突变体的重组质粒，用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切。1%琼脂糖凝胶电泳分析显示所有构建体在约900 bp处出现目标条带，确认UOX基因成功整合到载体中，验证了表达质粒的正确组装（图2C）。这些验证过的质粒随后转化至E. coli BL21(DE3)进行异源蛋白表达。IPTG诱导后，收集细胞，超声裂解，经镍亲和色谱纯化蛋白。SDS-PAGE分析（图3）确认纯化蛋白为约35.0 kDa的单一条带，与ExPASy ProtParam工具预测的分子量一致。
【数据】目标条带大小：约900 bp；琼脂糖凝胶浓度：1%；纯化蛋白分子量：约35.0 kDa；限制性内切酶：NdeI、BamHI；表达菌株：E. coli BL21(DE3)；纯化方法：镍亲和色谱
3.4 酶活性评估
使用酶标仪评估酶活性。Y243K-UOX在纯化蛋白中显示最高活性，被选为进一步表征（图4）。如表1所详述，Y243K-UOX的比活力比野生型高2.75倍，比活力分别为19.59 U/mg和7.13 U/mg。此外，该突变体表现出更有利的纯化特性，比活力提升2.61倍，而野生型为1.20倍。
【数据】Y243K-UOX比活力：19.59 U/mg；WT-UOX比活力：7.13 U/mg；比活力倍数：2.75倍；纯化倍数：Y243K-UOX 2.61倍 vs WT-UOX 1.20倍
3.5 分子动力学模拟与分子对接
均方根偏差（RMSD）值反映分子动力学（MD）过程中蛋白质的局部灵活性和原子迁移率。较高的RMSD值表示残基迁移率和灵活性增加，较低的值表示迁移率降低和结构刚性增强[42]。基于相对于初始结构的RMSD计算，分析WT-UOX和Y243K-UOX的结构稳定性，揭示了100 ns模拟期间不同的动力学模式（图5A）。两种酶在最初10 ns内RMSD均快速增加，表明发生了显著的结构调整。在10至70 ns之间，RMSD波动相当，表明野生型和突变体稳定性相似。此外，Y243K-UOX在70至100 ns期间持续显示比WT-UOX更高的RMSD值，表明突变导致结构偏差增大和稳定性降低。
均方根波动（RMSF）分析揭示了WT-UOX和Y243K-UOX在MD模拟过程中特定残基的灵活性（图5B）。虽然两种酶总体表现出相似的RMSF谱，反映基本的残基波动模式，但在特定区域出现了显著差异。Y243K-UOX在150–200位残基区域显示升高的RMSF值，表明该区域灵活性增强。该区域邻近底物进入通道，提示其增强的灵活性可能通过调节通道动力学促进底物可及性。大多数其他区段（0–150和200–300位残基）显示相当的波动模式，偏差为中低水平，表明稳定性相似。WT-UOX在300位残基附近显示显著峰值，而Y243K-UOX在该区域的波动减弱，表明突变诱导的稳定化。
配体结合过程中的氢键分析为蛋白质稳定性提供了见解[42]。在采用标准氢键标准（3.5 Å距离和135°角）的100 ns MD模拟中，WT-UOX和Y243K-UOX表现出不同的动力学模式（图5C）。Y243K-UOX维持显著更高的平均氢键数（0.570），而野生型为0.317，尽管WT-UOX的数值范围为0–5，Y243K-UOX为0–4。初始模拟阶段（0至10 ns）显示两种酶的氢键形成均有明显波动，表明结构正在调整。在关键的10–70 ns期间，Y243K-UOX表现出更强的氢键相互作用，其成键谱始终比野生型更稳定。这种稳定性优势持续到最后的70–100 ns阶段。这些观察表明，Y243K突变通过改善氢键持续性增强了结构动力学稳定性，这与观察到的构象灵活性变化相关。
对相互作用轨迹的进一步分析（图S3）显示，虽然野生型氢键涉及更多样的残基，但其持续时间较短。相比之下，Y243K-UOX与特定残基如Gln160、Pro286和Asn287形成稳定、持久的氢键，特别是在第200至800帧之间。此外，该突变体在Phe161和Phe164周围表现出增强的π-堆积相互作用，频率更高、持续时间更长。这种以关键残基间持续氢键和增强的π-堆积网络为特征的相互作用模式，为Y243K突变体结合稳定性改善的机制提供了结构解释。
使用分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MMPBSA）方法，通过评估WT-UOX和Y243K-UOX的100个稳定底物-酶复合物快照进行结合能计算。计算得到的结合能中，更负的值表示更强的结合稳定性，结果显示Y243K-UOX的结合亲和力（−78.532 kJ/mol）显著强于WT-UOX（−63.380 kJ/mol）。这些结果表明Y243K-UOX在UOX与其底物之间建立了更强的分子间相互作用和改善的结合稳定性。
WT-UOX和Y243K-UOX的比较三维对接分析如图6所示。整体蛋白折叠（图6A和6B，左图）基本保守，这与单点突变对蛋白质全局结构影响最小相一致。相比之下，底物结合口袋的检查（图6A和6B，右图）揭示了明显的局部重排。稳定底物的氢键网络……
【数据】模拟时长：100 ns；Y243K-UOX平均氢键数：0.570；WT-UOX平均氢键数：0.317；WT-UOX氢键范围：0–5；Y243K-UOX氢键范围：0–4；氢键标准：3.5 Å、135°；Y243K-UOX结合能：−78.532 kJ/mol；WT-UOX结合能：−63.380 kJ/mol；MMPBSA快照数：100；关键氢键残基：Gln160、Pro286、Asn287；π-堆积残基：Phe161、Phe164；RMSD差异时段：70–100 ns；RMSF升高区域：150–200位残基
3.6 重组WT-UOX和Y243K-UOX的酶学性质
原文在此处节选结束，酶学性质的具体数据原文未详述。根据摘要，Y243K-UOX显示出偏移的最适条件，在37°C和pH 8.0时活性最高，50°C孵育后保留残余活性，并表现出改善的抗化学变性能力，在尿素处理下活性保留率提高20%。
【数据】最适温度：37°C；最适pH：8.0；尿素处理活性保留率提升：20%；其余数据原文未详述
讨论与解读
尿酸氧化酶在嘌呤代谢中发挥关键作用，广泛用于多种疾病的治疗。商业UOX蛋白生产面临的挑战——如产量低、临床应用中纯化困难——促使研究者探索基于DNA重组技术的高效异源表达系统。重组UOX已获FDA批准用于临床高尿酸血症和肿瘤溶解综合征治疗，并用于酶法尿酸测定的诊断试剂盒生产。然而，现有重组UOX如拉布立酶的临床效用仍受固有局限制约，尤其是半衰期短和免疫原性增加。后者可引发过敏反应或被抗体中和，降低治疗效果。同时，UOX稳定性差也构成实际应用的重大障碍。因此，从多样化的微生物资源中探索具有理想特性的新型UOX势在必行。
本研究首次从冠突曲霉中克隆UOX基因，实现了在大肠杆菌中的异源表达，并通过多步结构导向策略获得了五个突变体。Y243K突变体比活力达野生型的2.75倍（19.59 U/mg vs 7.13 U/mg），结合能从−63.380 kJ/mol增强至−78.532 kJ/mol，氢键平均数量从0.317提升至0.570，且在尿素处理下活性保留率提高20%。分子动力学模拟揭示了突变体通过增强关键残基氢键持续性和π-堆积网络来提升稳定性的结构机制。
编译者解读： 该研究的方法论价值在于将计算工具（ESM-scan、AlphaFold3、MD模拟）与实验验证紧密耦合，形成从序列到功能的闭环筛选路径。选择冠突曲霉作为UOX来源的思路值得关注——系统发育距离可能降低免疫原性风险，但这一优势尚需免疫学实验验证。局限在于：突变体仅在大肠杆菌中表达，未评估真核表达系统或体内半衰期；酶学性质表征（如最适温度、pH、金属离子影响）的完整数据在节选中未充分呈现；尿素耐受性提升20%的临床转化意义需与现有药物进行头对头比较才能判断。
参考来源
期刊： Enzyme and Microbial Technology, 2026
DOI： 10.1016/j.enzmictec.2026.110922
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110922