来源：Metabolic engineering of Escherichia coli MG1655 for indigo production using naphthalene dioxygenase from Comamonas sp. MQ（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
靛蓝是纺织、食品与医药领域用量最大的染料之一，化学合成路线依赖苯胺、甲醛等有毒前体，环境负担沉重。本研究在大肠杆菌MG1655中异源引入色氨酸酶（TnaA）与萘双加氧酶（NDO），经酶源筛选、RBS工程、CRISPRi调控氧化应激、NADH供给强化与分子伴侣共表达等多步优化，摇瓶效价达2.38 g/L，5 L生物反应器补料分批发酵达6.90 g/L。该工作展示了从酶源适配到细胞鲁棒性的系统化改造路径。
研究背景
靛蓝作为不溶性蓝色染料已有三千余年历史，至今仍是纺织、食品着色与有机电子材料中不可或缺的原料。据预测，到2028年全球合成靛蓝市场需求将达16.4亿美元。当前全球每年数万吨的靛蓝需求主要依靠化学合成满足，该路线使用苯胺和甲醛等有毒前体，存在显著的环境与安全风险。植物提取虽为替代方案，但产量低、农业资源消耗大，规模化严重受限。传统生产方法在可持续性、安全性和资源效率方面均存在根本性局限。因此，基于可再生原料开发高效、清洁的生物合成路线已成为战略优先方向。微生物生产靛蓝在可持续性、环境兼容性和生产效率方面均优于化学合成与植物提取，已在大肠杆菌和恶臭假单胞菌等宿主中实现异源生产。
研究方法
2.1 化学品与菌株
本研究所用卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素、链霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）及培养基配方均为分析纯，购自阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。大肠杆菌JM109用作克隆宿主，携带pheA、trpR和yddG缺失的大肠杆菌MG1655菌株用作靛蓝生产宿主菌Ind-M00。所有其他菌株均基于Ind-M00构建，其完整基因型详见Table S1。
【数据】菌株：E. coli JM109（克隆宿主）、E. coli MG1655ΔpheAΔtrpRΔyddG（Ind-M00）；试剂：卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素、链霉素、IPTG；试剂来源：阿拉丁生化科技股份有限公司；原文未详述各试剂具体浓度（除后续章节列出的工作浓度外）
2.2 质粒、引物与基因编辑
本研究所用质粒详见Table S2，相应引物见Table S3。编码TnaA和NDO的基因由金斯瑞生物科技股份有限公司（中国南京）合成并密码子优化。将这些基因插入pCO-tac-tac质粒载体后，分别以pCO-tac-tac-NDO1、pCO-tac-tac-NDO2或pCO-tac-tac-NDO3为模板，使用引物对pCO-V-tac1-F/R进行PCR扩增。色氨酸酶基因片段使用引物对EctnaA-F/R、MitnaA-F/R、PretnaA-F/R和PvtnaA-F/R扩增。含有12种不同TnaA和NDO来源组合的质粒使用Gibson Assembly试剂盒（New England Biolabs, NEB）构建。基因整合到大肠杆菌MG1655ΔtrpRΔpheAΔyddG基因组中使用CRISPR-Cpf1系统完成。ldhA位点和yggE的上游和下游同源臂通过PCR扩增并组装以构建供体DNA片段。ldhA sgRNA表达盒插入pcrEG载体以生成pcrEG-ldhA。供体DNA片段和pcrEG-ldhA质粒共电穿孔到携带pEcCpf1的宿主细胞中。通过菌落PCR筛选的阳性克隆使用引物对YZ-yggE-F/R进行验证。本研究中提到的所有其他基因均来自大肠杆菌MG1655基因组。这些构建体使用相应引物对和Gibson Assembly试剂盒（New England Biolabs, NEB）生成。所有构建的质粒均通过Sanger测序（Azenta，中国苏州）验证。
【数据】质粒载体：pCO-tac-tac、pcrEG、pEcCpf1；基因编辑系统：CRISPR-Cpf1；组装试剂盒：Gibson Assembly（NEB）；验证方法：菌落PCR（引物YZ-yggE-F/R）、Sanger测序（Azenta，苏州）；基因合成公司：金斯瑞（南京）；原文未详述PCR扩增的具体温度和时间参数
2.3 CRISPR干扰系统的构建
基因阻遏通过CRISPR干扰（CRISPRi）系统介导，方法同先前报道（Lv et al., 2015）。sgRNA包含一个20核苷酸靶向序列，通过改变该序列实现对不同靶基因的阻遏。N20序列的设计原则是靶向非模板DNA链的5′端，优先选择ATG起始密码子下游约100 bp处，若该距离不可行则选择更远端位点。sgRNA表达质粒plv-dcas9-sgRNA-X使用相应引物对构建。
【数据】CRISPRi系统：plv-dcas9-sgRNA；sgRNA靶向序列长度：20核苷酸；靶向位置：非模板DNA链5′端，ATG下游约100 bp处优先；原文未详述sgRNA构建的具体PCR条件和质粒构建参数
2.4 培养基、培养条件与补料分批发酵
Luria-Bertani（LB）液体培养基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl）和固体培养基（补充15 g/L琼脂）用于质粒构建和菌株培养。将质粒转化到生产宿主菌株后，转化子在LB琼脂平板上于37 °C培养12 h。将菌落转移至4 mL LB液体培养基中，于37 °C培养10-12 h。将2%（v/v）接种量转移到25 mL靛蓝发酵培养基中，该培养基含5 g/L酵母提取物、20 g/L甘油、4 g/L色氨酸、6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、0.49 g/L MgSO₄·7H₂O和0.02 g/L CaCl₂。根据需要添加适当抗生素（50 μg/mL卡那霉素、34 μg/mL氯霉素、100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL链霉素）以维持质粒稳定性。培养物在37 °C下培养。当细胞在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）达到0.6-0.8时，添加IPTG至终浓度0.2 mM。随后将温度降至30 °C，继续发酵48 h以生产靛蓝。菌株Ind-M38用于在5 L生物反应器（T&J Bioengineering，中国上海）中进行补料分批发酵，工作体积为2 L。发酵培养基含15 g/L葡萄糖、4 g/L色氨酸、10 g/L酵母提取物、0.3 g/L柠檬酸铁铵、2.1 g/L一水合柠檬酸、1 g/L NaCl、3 g/L K₂HPO₄·3H₂O、3 g/L (NH₄)₂SO₄、0.3 g/L聚醚消泡剂和1%（v/v）微量元素溶液（10 g/L FeSO₄·7H₂O、2.25 g/L ZnSO₄·7H₂O、1 g/L CuSO₄·5H₂O、0.5 g/L MnSO₄·5H₂O、2 g/L CaCl₂·2H₂O、0.23 g/L Na₂B₄O₇·10H₂O和0.1 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄）。培养在37 °C下启动，pH使用50%（v/v）氨水自动维持在6.8。初始搅拌速度和通气速率分别设为200 rpm和1 vvm。溶解氧（DO）通过调节搅拌速度自动维持在约40%空气饱和度。当OD₆₀₀达到约15时，温度降至30 °C，并添加IPTG至终浓度0.2 mM以诱导靛蓝生物合成。当残余葡萄糖浓度降至3-5 g/L时开始补料溶液（600 g/L葡萄糖、20 g/L MgSO₄·7H₂O）；色氨酸溶液（200 g/L色氨酸）以2 mL/h速度补加以维持色氨酸浓度在1-5 g/L。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、固体LB（+15 g/L琼脂）、靛蓝发酵培养基（5 g/L酵母提取物、20 g/L甘油、4 g/L色氨酸、6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、0.49 g/L MgSO₄·7H₂O、0.02 g/L CaCl₂）；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、链霉素50 μg/mL；接种量：2%（v/v）；诱导条件：OD₆₀₀ 0.6-0.8时加IPTG至0.2 mM，温度降至30 °C，发酵48 h；生物反应器：5 L（工作体积2 L）；发酵培养基：15 g/L葡萄糖、4 g/L色氨酸、10 g/L酵母提取物、0.3 g/L柠檬酸铁铵、2.1 g/L一水合柠檬酸、1 g/L NaCl、3 g/L K₂HPO₄·3H₂O、3 g/L (NH₄)₂SO₄、0.3 g/L聚醚消泡剂、1%（v/v）微量元素溶液；pH：6.8（50%氨水自动维持）；初始搅拌：200 rpm；通气：1 vvm；DO：约40%空气饱和度；诱导条件：OD₆₀₀约15时降温至30 °C、IPTG 0.2 mM；补料：600 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO₄·7H₂O（残糖3-5 g/L时启动）、200 g/L色氨酸以2 mL/h补加（维持1-5 g/L）
2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
将质粒pCO-tac-EctnaA-tac-RBS10-NDO2、pTrc99a-tac-gldA和pCD-tac-dnaj分别转化到宿主菌大肠杆菌MG1655ΔtrpRΔpheAΔyddGΔldhA::yggE中作为发酵菌株。发酵18 h后收集样品。发酵液离心（8000 rpm，10 min，4 °C）分离细胞与培养基。弃上清，细胞沉淀重悬于25 mL冰预冷磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.8）中，离心洗涤至上清几乎无色。称取约1 g湿细胞沉淀，重悬于5 mL冰预冷PBS中。细胞悬液使用超声匀浆器（220 W；开5 s，关5 s）超声处理，总有效时长15 min。所得沉淀用冰预冷PBS反复离心洗涤（12,000 rpm，10 min，4 °C）至上清几乎无色，随后重悬于等体积冰预冷PBS（pH 6.8）中得到不溶性沉淀悬液。取30 μL总发酵液、可溶性上清和不溶性沉淀分别与10 μL SDS-PAGE上样缓冲液混合。混合物在金属浴加热器（10 min，100 °C）中加热使蛋白质变性。加热后，样品离心（10,000 rpm，5 min，4 °C）。取20 μL各上清上样至凝胶。电泳先在80 V下进行至染料前沿进入分离胶，随后将电压升至120 V。电泳结束后，凝胶经染色和脱色以显示蛋白条带。
【数据】质粒：pCO-tac-EctnaA-tac-RBS10-NDO2、pTrc99a-tac-gldA、pCD-tac-dnaj；宿主：E. coli MG1655ΔtrpRΔpheAΔyddGΔldhA::yggE；取样时间：发酵18 h；离心条件：8000 rpm、10 min、4 °C（发酵液），12,000 rpm、10 min、4 °C（洗涤）；PBS：pH 6.8，冰预冷；超声条件：220 W，开5 s/关5 s，总有效15 min；上样量：30 μL样品+10 μL上样缓冲液，取20 μL上样；变性条件：100 °C、10 min；离心条件：10,000 rpm、5 min、4 °C；电泳电压：80 V（浓缩胶）、120 V（分离胶）
2.6 细胞内ROS水平和NADH水平的测定
ROS水平使用ROS检测试剂盒（碧云天，中国上海）测定。非荧光DCFH-DA探针被细胞内ROS氧化生成2′,7′-二氯荧光素（DCF），发出强烈绿色荧光（Duan et al., 2016）。培养48 h后收集发酵液。离心收获细胞，用冰预冷PBS洗涤三次。测定前，使用冰预冷PBS将各样品细胞密度归一化至OD₆₀₀为0.5。细胞悬液重悬于含10 μM DCFH-DA的PBS中，于37 °C避光孵育40 min。孵育后，使用Tecan Infinite® M200 Pro酶标仪（Tecan Group Ltd.，瑞士Männedorf）在激发波长488 nm、发射波长525 nm下测定荧光强度。荧光强度相对于对照进行归一化。
【数据】试剂盒：ROS检测试剂盒（碧云天，上海）；探针：DCFH-DA（10 μM）；孵育条件：37 °C、避光、40 min；细胞密度归一化：OD₆₀₀=0.5；检测仪器：Tecan Infinite® M200 Pro酶标仪；激发波长：488 nm；发射波长：525 nm；取样时间：培养48 h后
研究结果
3.1 筛选不同来源的TnaA和NDO以提高靛蓝产量
工程大肠杆菌中靛蓝生物合成由两个关键酶TnaA和NDO介导。TnaA催化L-色氨酸水解为吲哚，吲哚随后被NDO氧化为吲哚酚。吲哚酚随后自发二聚化形成靛蓝（图1）。
为开发高产菌株，系统筛选了来自不同生物来源的TnaA和NDO同源物。选取了三种不同的NDO同源物：来自恶臭假单胞菌的NDO1（AAB47590.1, AAB47591.1, AAB47592.1）、来自Comamonas sp. MQ的NDO2（JN655512.1）和来自恶臭假单胞菌的NDO3（AB237655.1）。此外，选取了四种TnaA同源物：来自大肠杆菌的EcTnaA（NP_418164.4）、来自Mageeibacillus indolicus的MiTnaA（WP_012992776.1）、来自Providencia rettgeri的PreTnaA（WP_042846291.1）和来自Proteus vulgaris的PvTnaA（WP_036934959.1）。这些基因被组装到基于质粒的组合构建体中，并转化到工程靛蓝生产宿主菌大肠杆菌Ind-M00中，共获得12株重组菌株（Ind-M01至Ind-M12）（图2A）。
摇瓶发酵结果显示工程菌株间靛蓝产量存在显著差异，表明酶来源对生物合成效率有关键影响（图2B）。共表达EctnaA和NDO2的菌株Ind-M02产生最高靛蓝效价1.63 g/L，最终OD₆₀₀达18.12。在测试的三种NDO变体中，NDO2与任何异源TnaA组合均支持最高靛蓝效价。同样，在评估的四种TnaA直系同源物中，EcTnaA在所有NDO背景下均 consistently 表现最佳。Comamonas sp. MQ来源的NDO在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达并在优化培养条件下将靛蓝效价提高至205 mg/L（Zhang et al., 2013）。本研究中，所有四种共表达NDO2与异源TnaA变体的菌株均以克每升级别生产靛蓝。先前研究证明在谷氨酸棒杆菌全细胞系统中，EcTnaA表现出高体外催化效率，而PreTnaA产生最高终产物效价（Mindt et al., 2022）。本研究中，EcTnaA与NDO2组合时不仅超越PreTnaA，而且在所有三种NDO同工型（NDO1-NDO3）中均产生最高效价，突显了其在该底盘中的卓越兼容性和鲁棒性。这表明酶的兼容性和催化效能受宿主生物和特定代谢途径环境的双重关键影响。
【数据】菌株：Ind-M01至Ind-M12（12株重组菌株）；NDO来源：NDO1（P. putida, AAB47590.1/AAB47591.1/AAB47592.1）、NDO2（Comamonas sp. MQ, JN655512.1）、NDO3（P. putida, AB237655.1）；TnaA来源：EcTnaA（E. coli, NP_418164.4）、MiTnaA（M. indolicus, WP_012992776.1）、PreTnaA（P. rettgeri, WP_042846291.1）、PvTnaA（P. vulgaris, WP_036934959.1）；最高效价：Ind-M02（EctnaA+NDO2）1.63 g/L，OD₆₀₀=18.12；文献对比：NDO2在BL21(DE3)中效价205 mg/L（Zhang et al., 2013）
3.2 通过RBS工程优化NDO2表达
NDO2是催化吲哚转化为靛蓝的关键酶，其表达水平是靛蓝生物合成途径通量的关键决定因素。RBS强度的精确调节可优化核糖体-mRNA结合效率，从而实现对目标基因表达的精确高效控制（Oesterle et al., 2017）。我们构建了不同的RBS变体，并将每个变体插入表达质粒pCO-tac-EctnaA-tac-NDO2中nagAa（NDO2操纵子的第一个编码基因）上游的5′非翻译区。由此获得15株工程大肠杆菌菌株，命名为Ind-M13至Ind-M27（图3A）。
其中，六个变体（Ind-M13至Ind-M18）使用RBS Calculator设计，预测翻译起始速率（TIR）跨度从1.01到1.1×10⁵任意单位（Salis et al., 2009）。为减轻计算预测与实际翻译效率之间的潜在差异，我们纳入了来自Duan等人的另外九个实验验证的RBS序列（Duan et al., 2022）。这些序列在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表现出一致的翻译活性和序列保守性。根据其报道的强度层级，这九个RBS变体被分为低（Ind-M19-Ind-M22）、中（Ind-M23-Ind-M24）和高（Ind-M25-Ind-M27）（图3B）。在所有测试菌株中，菌株Ind-M22、Ind-M23和Ind-M17达到相当高的靛蓝效价，均显著高于对照菌株Ind-M02。具体而言，携带低强度RBS的菌株Ind-M22产生2.00 g/L，相较于Ind-M02效价提高23%，最终OD₆₀₀提高17%。其表现出最稳定的性能，因此被选为后续工程的宿主。携带中等强度RBS的菌株Ind-M23和TIR约10,000的RBS的菌株Ind-M17也表现出高性能，靛蓝效价分别为1.98 g/L和1.97 g/L（图3C）。为研究蛋白质表达与靛蓝产量之间的相关性，对产量最高的六株菌株进行了SDS-PAGE分析。该分析显示，测试菌株相对于对照菌株表现出更高的蛋白质表达水平，表明RBS强度、NDO2表达与靛蓝效价之间存在联系（Fig. S1）。数据表明靛蓝生产依赖于最优TIR，超过该值后NDO2表达的进一步增加导致产量下降。表达不足限制催化能力，而过度表达可能损害整体途径效率，可能是由于代谢负担或细胞资源竞争（Xu et al., 2013）。在六个计算设计的菌株（Ind-M13至Ind-M18）中，靛蓝产量通常随预测TIR升高而增加，在Ind-M17达到峰值。相反，达到最高预测TIR（Ind-M18）导致较低的靛蓝产量（1.48 g/L），表明过量的NDO2表达破坏代谢平衡并损害产物形成。
【数据】菌株：Ind-M13至Ind-M27（15株）；RBS设计方法：RBS Calculator（6个变体，Ind-M13至Ind-M18，TIR范围1.01至1.1×10⁵任意单位）+ 文献验证序列（9个变体，Ind-M19至Ind-M27，分低/中/高强度）；最高效价：Ind-M22（低强度RBS）2.00 g/L，较Ind-M02提高23%，OD₆₀₀提高17%；Ind-M23（中等强度RBS）1.98 g/L；Ind-M17（TIR约10,000）1.97 g/L；Ind-M18（最高预测TIR）1.48 g/L；对照：Ind-M02为1.63 g/L
3.3 缓解氧化应激以增强产靛蓝大肠杆菌的生长鲁棒性
RBS工程成功提高了靛蓝产量（图3C），但多组分NDO2的异源表达已知会因催化过程中的电子泄漏而产生ROS（Planchestainer et al., 2025; Schieber & Chandel, 2014; Zheng et al., 2024）。这种氧化应激有可能限制高产菌株的生长鲁棒性（Priya Dharshini et al., 2020）。为测试缓解氧化应激是否能进一步改善细胞生长和宿主鲁棒性，我们采用CRISPRi技术系统调控与氧化应激反应相关的基因。我们选取了若干与氧化应激调控相关的基因，包括（a）氧化应激感应和转录调控网络的组分，（b）抗氧化酶和ROS解毒系统，以及（c）铁稳态调节因子和铁储存蛋白（Table S4）（Garcia-Llorens et al., 2025）。我们采用CRISPRi技术阻遏这些基因（图4A）。
筛选前，将CRISPRi工具质粒（plv-tetR-dCas9-sgRNA）引入菌株Ind-M22以评估其潜在代谢负担。结果表明CRISPRi系统对生长影响可忽略，但导致靛蓝产量轻微下降（Fig. S1）。这可能是dCas9毒性的影响（Cui et al., 2018）。为控制CRISPRi质粒带来的负担，每个实验组均包含空载体对照菌株（Ind-M28）。我们构建了24个CRISPRi质粒，每个携带靶向一个氧化应激反应相关基因的sgRNA（Table S4），并将其引入工程菌株Ind-M22以筛选能够缓解细胞内氧化应激并改善生长鲁棒性的候选基因。阻遏氧化应激相关基因同时影响细胞密度和靛蓝产量（图4B）。出乎意料的是，经过反复实验重复后，我们筛选的基因中几乎没有增加靛蓝产量的。阻遏arcA、arcB、katG、katE、ftnA和fumC共同增强了细胞生长鲁棒性。
【数据】菌株：Ind-M22（宿主）、Ind-M28（空载体对照）；CRISPRi质粒：plv-tetR-dCas9-sgRNA；构建CRISPRi质粒数：24个（每个靶向一个氧化应激相关基因）；筛选基因类别：（a）氧化应激感应和转录调控网络组分，（b）抗氧化酶和ROS解毒系统，（c）铁稳态调节因子和铁储存蛋白；CRISPRi对生长影响：可忽略；对靛蓝产量影响：轻微下降；有效基因：arcA、arcB、katG、katE、ftnA、fumC（共同增强细胞生长鲁棒性，但几乎未增加靛蓝产量）
3.4 增强NADH供给与扩展NAD(H)池
3.5 分子伴侣共表达增强NDO可溶性表达
3.6 补料分批发酵生产靛蓝
讨论与解读
本研究为从色氨酸出发实现靛蓝生物合成，优化了两个关键酶TnaA和NDO的活性。此外，通过改善细胞鲁棒性、细胞内NADH可用性和NDO溶解度增强了生产菌株。最终在摇瓶和放大生物反应器培养中均实现了高效靛蓝生产，5 L生物反应器中效价达6.90 g/L。
从方法学角度看，该工作体现了合成生物学"设计-构建-测试-学习"循环中多层面协同优化的思路：酶源筛选解决的是途径起点催化效率与兼容性问题；RBS工程调控的是途径通量的精细平衡——Ind-M22以低强度RBS取得最高效价，说明过量表达反而破坏代谢平衡；CRISPRi筛选氧化应激靶点虽未直接提升产量，但揭示了arcA、arcB等基因在生长鲁棒性中的潜在作用；NADH供给强化与分子伴侣共表达则分别从辅因子和蛋白质折叠两个层面消除瓶颈。最终摇瓶2.38 g/L、反应器6.90 g/L的效价在已报道的微生物靛蓝合成中处于较高水平。
局限方面，CRISPRi筛选的24个氧化应激基因几乎均未提升靛蓝产量，提示氧化应激与产量之间的关联可能比预期复杂，或需从多基因协同调控入手。此外，NDO2多组分复合物的电子泄漏问题尚未从根本上解决，分子伴侣共表达仅是缓解策略。未来工作可考虑将NADH再生与氧化应激缓解整合为全局调控回路，以进一步释放生产潜力。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109347
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109347