来源：A bioactive lysate of Corynebacterium glutamicum orchestrates intestinal barrier repair mainly through L-arginine-mediated FOXO pathway（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
炎症性肠病（IBD）的核心病理特征是肠道屏障功能受损。后生元因稳定性与安全性优于益生菌而备受关注。谷氨酸棒杆菌是公认安全的工业微生物，但其裂解物修复肠道屏障的效果与机制尚不清楚。本研究以DSS诱导结肠炎小鼠模型和LPS诱导的Caco-2细胞炎症屏障模型，系统评价谷氨酸棒杆菌裂解液（CG-LS）的屏障修复作用。结果首次发现CG-LS的修复效果优于活菌，并锁定L-精氨酸为关键活性成分，FOXO通路为核心调控枢纽。
研究背景
炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是全球性的慢性胃肠道疾病负担，在工业化与新兴经济体中发病率持续上升。肠道屏障功能严重受损是IBD的标志性病理特征，表现为黏液层耗竭、肠上皮细胞凋亡增加以及紧密连接蛋白结构破坏。这种"漏肠"状态使微生物抗原和促炎因子异常易位，持续激活黏膜免疫系统，导致难治性慢性炎症。因此，修复受损的肠上皮屏障——而非仅仅抑制炎症——已成为IBD治疗的重要靶点。
近年来，基于微生物的干预策略，尤其是益生菌，在调节肠道稳态方面受到广泛关注。但活益生菌的应用面临加工、储存和胃肠道转运过程中活力下降的限制，以及菌血症等潜在风险，尤其在免疫受损人群中。后生元——即无生命微生物或其成分——因稳定性和安全性优势，正逐步成为替代方案。谷氨酸棒杆菌是工业上广泛使用的GRAS（公认安全）微生物，但其裂解物对肠道屏障的修复效果和机制此前基本未被探索。
研究方法
2.1 谷氨酸棒杆菌裂解上清的制备
将谷氨酸棒杆菌接种于脑心浸液（BHI）肉汤中，在37 °C厌氧条件下培养至对数生长后期（OD₆₀₀ ≈ 2.5）。通过离心收获菌体，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）洗涤三次。将菌体沉淀重悬于PBS中至终浓度107 CFU/mL。该菌悬液在冰浴中使用超声细胞破碎仪进行超声处理，条件如下：功率400 W，15 s脉冲交替15 s间隔，总时长40 min。随后，裂解液在4 °C下以12,000 ×g离心10 min，收集上清液并通过0.22 μm无菌滤膜过滤，获得谷氨酸棒杆菌裂解上清液，命名为CG-LS。分装后于−80 °C保存备用。对于热灭活对照，将活谷氨酸棒杆菌（CG）和活嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）分别悬浮于PBS中，在70 °C水浴中加热30 min。将每种热处理悬液100 μL涂布于BHI琼脂上，37 °C培养48 h后无菌落形成，确认灭活完成。所得制品分别命名为巴氏灭活CG（PCG）和巴氏灭活AKK（PAKK），于−80 °C保存备用。
【数据】菌株：谷氨酸棒杆菌；培养基：BHI肉汤；温度：37°C；OD₆₀₀：≈2.5；PBS：pH=7.4；浓度：107 CFU/mL；超声功率：400W；脉冲：15s/15s；总时长：40min；离心：12,000×g，10min，4°C；滤膜：0.22μm；热灭活：70°C，30min；灭活验证：BHI琼脂，37°C，48h
2.2 细胞培养与炎症模型建立
Caco-2细胞（ATCC HTB-37™）在最低必需培养基（MEM；Procell，武汉，中国）中培养，补充10%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素，于37 °C、5% CO₂气氛中培养。培养基每2天更换一次。当细胞达到80–90%汇合度时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液以1:3比例传代。为建立肠上皮屏障模型，将细胞以1 × 10⁵细胞/孔的密度接种于Transwell聚碳酸酯膜插入物（孔径0.4 μm）上。每2天更换培养基，培养21天以形成完全分化的单层，通过稳定的跨上皮电阻（TEER > 500 Ω·cm²）确认屏障成熟。对于炎症损伤模型，将10 μg/mL脂多糖（LPS）加入基底侧腔室处理24 h。
【数据】细胞：Caco-2（ATCC HTB-37™）；培养基：MEM+10% FBS+1%非必需氨基酸+1%青霉素-链霉素；温度：37°C；CO₂：5%；传代比例：1:3；胰蛋白酶：0.25%；接种密度：1×10⁵细胞/孔；Transwell孔径：0.4μm；培养时间：21天；TEER阈值：>500 Ω·cm²；LPS浓度：10μg/mL；LPS处理时间：24h
2.3 动物实验
所有动物实验经西北大学机构动物护理与使用委员会批准（NWU-AWC-20240603 M）。6–8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为四组（每组n = 8）：1）对照组：自由饮水并常规灌胃，命名为Con组；2）DSS模型组：饮水中含2.5%葡聚糖硫酸钠，持续7天诱导急性结肠炎，命名为Model组；3）DSS + 谷氨酸棒杆菌治疗组：在DSS诱导期间每日灌胃200 μL含10⁸ CFU活谷氨酸棒杆菌的PBS悬液，命名为CG组；4）DSS + 5-氨基水杨酸（5-ASA）治疗组：在DSS诱导期间每日灌胃200 μL含200 mg/kg/d 5-ASA的PBS悬液，命名为5-ASA组。每日记录体重、粪便稠度和粪便隐血，计算疾病活动指数（DAI）。实验结束时，处死小鼠，收集结肠组织测量长度，切片或固定于4%多聚甲醛用于苏木精-伊红（H&E）染色，或于−80 °C冻存用于后续分子分析。
【数据】动物：雄性C57BL/6小鼠，6–8周龄；每组n=8；DSS浓度：2.5%；DSS诱导时间：7天；CG剂量：10⁸ CFU，200μL/天；5-ASA剂量：200 mg/kg/d，200μL/天；固定液：4%多聚甲醛；冻存：−80°C
2.4 体外实验设计与分组
Caco-2细胞分为以下六组：1）对照组：正常培养基培养，不做任何处理；2）模型组：10 μg/mL LPS处理24 h诱导炎症；3）CG组：炎症细胞用活谷氨酸棒杆菌（107 CFU/mL）处理6–24 h；4）PCG组：炎症细胞用巴氏灭活谷氨酸棒杆菌（107 CFU/mL）处理6–24 h；5）PAKK组：炎症细胞用巴氏灭活嗜黏蛋白阿克曼菌（107 CFU/mL）处理6–24 h；6）CG-LS组：炎症细胞用CG-LS（107 CFU/mL）处理6–24 h。为评估L-精氨酸（L-Arg）的保护作用，Caco-2细胞分为以下七组：1）对照组：正常培养基培养，不做任何处理；2）模型组：10 μg/mL LPS处理24 h诱导炎症；3）L-Arg组：炎症细胞用L-Arg（0.5 mM）处理6 h；4）L-Arg + AS1842856组：炎症细胞先用AS1842856（0.5 μM，特异性FOXO1抑制剂，Tsbiochem，上海，中国）处理1 h后再用L-Arg处理；5）CG-LS治疗组：炎症细胞用CG-LS（107 CFU/mL）预处理6 h；6）CG-LS + AS1842856组：炎症细胞先用AS1842856（0.5 μM）处理1 h后再用CG-LS处理；7）L-PTH组：0.5 mM含L-脯氨酸、L-色氨酸和L-组氨酸的混合物，摩尔比2.7:4.5:1.0，与CG-LS中测得的比例相同。
【数据】LPS：10μg/mL，24h；CG/PCG/PAKK/CG-LS浓度：107 CFU/mL；处理时间：6–24h；L-Arg：0.5mM，6h；AS1842856：0.5μM，1h；L-PTH：0.5mM，摩尔比2.7:4.5:1.0
2.5 细胞活力测定
Caco-2细胞以5 × 10³细胞/孔密度接种于96孔板，随后暴露于10 μg/mL LPS处理24 h。将1 × 10⁶至1 × 10⁸ CFU/mL的CG-LS加入培养基，细胞继续培养6 h。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定细胞活力。简言之，无菌条件下向每孔加入MTT溶液（终浓度0.5 mg/mL），孵育4 h。随后吸去上清，将甲臜晶体溶解于MTT溶剂中。使用酶标仪（美谷分子仪器，上海，中国）在570 nm处测定吸光度。细胞活力以相对于未处理对照组（设为100%）的百分比表示。
【数据】接种密度：5×10³细胞/孔；LPS：10μg/mL，24h；CG-LS浓度范围：1×10⁶–1×10⁸ CFU/mL；处理时间：6h；MTT终浓度：0.5mg/mL；孵育：4h；检测波长：570nm
2.6 实时定量PCR（qPCR）分析
Caco-2细胞（1 × 10⁵细胞/孔）接种于100 mm培养皿中，孵育14–21天（37 °C，5% CO₂）。细胞随后暴露于10 μg/mL LPS处理24 h，再用CG-LS（107 CFU/mL）处理6 h。总RNA提取和逆转录分别使用总RNA提取试剂盒（Solarbio，北京，中国）和HiScript® II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，南京，中国），按照制造商方案进行。实时PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京，中国）在LightCycler 480II荧光定量PCR检测系统（Roche Diagnostics，瑞士）上以SYBR® Green法进行。本研究所用引物（擎科生物，北京，中国）列于表1。相对基因表达水平以2-ΔΔCt法计算，以GAPDH作为内参基因。
【数据】接种密度：1×10⁵细胞/孔；培养皿：100mm；孵育时间：14–21天；温度：37°C；CO₂：5%；LPS：10μg/mL，24h；CG-LS：107 CFU/mL，6h；内参基因：GAPDH；方法：2-ΔΔCt
2.7 活性氧（ROS）测定
Caco-2细胞以5 × 10³细胞/孔密度培养于6孔板中14–21天。细胞随后暴露于10 μg/mL LPS处理24 h，再用CG-LS（107 CFU/mL）处理6 h。用PBS冲洗两次后，细胞在无血清培养基中与10 μM 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）在暗处孵育30 min。随后用PBS洗涤三次去除未装载的DCFH-DA。使用倒置荧光显微镜记录荧光强度，使用ImageJ软件定量分析ROS生成。
【数据】接种密度：5×10³细胞/孔；培养板：6孔；培养时间：14–21天；LPS：10μg/mL，24h；CG-LS：107 CFU/mL，6h；DCFH-DA：10μM；孵育：30min，暗处；洗涤：PBS×3
2.8 屏障完整性与通透性测定
通过测量Caco-2细胞单层的TEER评估肠道屏障完整性，通过监测4 kDa异硫氰酸荧光素偶联（FITC）-葡聚糖（FD-4，碧云天生物技术公司，上海，中国）的通量评估通透性。Caco-2细胞在Transwell小室中预孵育21天。TEER值通过Millicell-ERS监测。
【数据】FD-4分子量：4kDa；Transwell预孵育：21天；TEER检测仪：Millicell-ERS
研究结果
3.1 谷氨酸棒杆菌及其裂解液对肠道屏障的保护作用
如图S1A–C所示，所有DSS处理（UC）小鼠与对照组健康小鼠相比均表现出显著的体重下降。在接下来的7天中，UC小鼠经口给予5-ASA（200 mg/kg/天）或活谷氨酸棒杆菌（CG）（10⁸ CFU，300 μL/天）。治疗期结束时，5-ASA组和CG组与模型组相比体重均显著增加（p < 0.05）。相应地，口服5-ASA和CG均显著恢复了结肠长度（图S1A–C）。同时，H&E染色组织学评估进一步表明，5-ASA和CG治疗均减轻了DSS诱导的结肠炎（图S1D）。此外，基于16S rRNA基因测序的微生物多样性分析结合KEGG通路富集揭示了治疗后代谢通路的明显改变。值得注意的是，CG组在氨基酸代谢通路中表现出最显著的富集（图S1E）。这些发现表明谷氨酸棒杆菌可能是有益微生物资源的一员。然而，细菌细胞内关键的 protective 成分及其对肠上皮细胞的作用仍有待阐明。
【数据】DSS处理：体重显著下降；5-ASA：200 mg/kg/天；CG：10⁸ CFU，300μL/天；治疗时间：7天；体重增加：p<0.05；结肠长度：显著恢复；16S rRNA测序：CG组氨基酸代谢通路最显著富集
为解决上述问题，我们制备了CG-LS并通过MTT法评估其对Caco-2细胞的潜在细胞毒性。结果（图S2）表明，浓度为106至108 CFU/mL的CG-LS处理6 h未显著损害细胞活力。值得注意的是，在107 CFU/mL浓度下，细胞活力达到对照组的112.5% ± 0.58。形态学图像进一步证实，该剂量CG-LS处理的细胞具有与对照组相似的正常生长状态（图S3）。因此，选择无细胞毒性且效果适中的107 CFU/mL剂量用于所有后续体外实验（图1A）。
【数据】CG-LS浓度范围：106–108 CFU/mL；处理时间：6h；107 CFU/mL时细胞活力：112.5% ± 0.58；选定剂量：107 CFU/mL
随后，通过Caco-2肠上皮模型评估CG-LS在LPS诱导的屏障损伤中的效果。如图1B所示，LPS处理显著损害屏障完整性，在6 h内将TEER值降至初始水平的27.95% ± 0.052。相比之下，CG-LS（107 CFU/mL）干预显著逆转了这种损害，在6 h时将TEER恢复至对照值的0.46 ± 0.036倍。值得注意的是，这种恢复效果优于同等CFU的活谷氨酸棒杆菌（CG组，0.39 ± 0.025倍）或巴氏灭活谷氨酸棒杆菌（PCG组，0.44 ± 0.025倍）。同时，LPS处理使FITC-葡聚糖通透性增加9.35 ± 0.27倍，而CG-LS处理将这种升高的通透性降低至模型组的0.19 ± 0.07倍（图1C-D）。CG-LS降低通透性的效果也超过了PAKK处理，后者仅将通透性降至模型组的0.21 ± 0.076倍。嗜黏蛋白阿克曼菌是一种降解黏蛋白的细菌，天然定植于肠道黏液层，在黏膜稳态和屏障功能中发挥重要作用。这些结果首次证明谷氨酸棒杆菌裂解上清液组分（CG-LS）比活菌或巴氏灭活制品具有更优的受损肠道屏障修复能力，突显了其作为有效后生元的潜力。
【数据】LPS处理6h TEER：27.95% ± 0.052；CG-LS恢复TEER：0.46 ± 0.036倍；CG组：0.39 ± 0.025倍；PCG组：0.44 ± 0.025倍；LPS增加FITC-葡聚糖通透性：9.35 ± 0.27倍；CG-LS降低通透性：0.19 ± 0.07倍；PAKK：0.21 ± 0.076倍
3.2 CG-LS调控炎症因子合成与紧密连接蛋白
肠道屏障破坏与失控的炎症反应和紧密连接结构解体密切相关。为阐明CG-LS介导屏障修复的分子机制，我们首先检测了其对关键炎症因子的调控作用。如图2A-F所示，LPS刺激显著上调了促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8的mRNA表达，同时抑制了抗炎因子IL-10和TGF-β的表达。CG-LS干预6 h后，这种失调的炎症状态被显著逆转。IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8的表达呈时间依赖性下降，在处理后6 h达到最低点，与对照组相比分别降低了5.0倍、6.40倍、6.82倍和5.36倍。同时，TGF-β和IL-10表达分别增加了2.79倍和2.06倍。值得注意的是，与活CG和PCG组相比，CG-LS在抑制IL-6和诱导IL-10方面表现出显著更强的效果（图2）。这些发现表明CG-LS在将炎症微环境重塑为促修复状态方面具有独特优势。
【数据】CG-LS处理：6h达最低点；IL-6降低：5.0倍；TNF-α降低：6.40倍；IL-1β降低：6.82倍；IL-8降低：5.36倍；TGF-β增加：2.79倍；IL-10增加：2.06倍
鉴于紧密连接构成屏障功能的物理基础，我们进一步研究了CG-LS对核心紧密连接蛋白的影响。图3A-F显示，LPS刺激显著降低了Occludin-1、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）、MUC2、E-钙黏蛋白、Claudin-1和TFF3的mRNA表达水平。与此形成鲜明对比的是，CG-LS处理有效抵消了这种破坏，在6 h观察到峰值效果。Occludin-1和ZO-1的mRNA水平分别恢复至对照值的1.38倍和4.37倍，而MUC2、E-钙黏蛋白、Claudin-1和TFF3的表达也显著上调。这些增加显著高于活CG处理（增加3.42倍）和PAKK处理（无显著增强）。蛋白表达模式与mRNA变化密切平行。抗炎效果与屏障结构蛋白增强之间的时间同步性（均在6 h达到峰值）表明CG-LS可能通过协同作用驱动屏障修复（图S4）。
【数据】CG-LS峰值效果：6h；Occludin-1恢复：1.38倍；ZO-1恢复：4.37倍；活CG增加：3.42倍；PAKK：无显著增强
3.3 CG-LS减轻氧化应激并逆转LPS诱导的细胞周期阻滞
除炎症外，氧化应激和上皮更新受损是导致屏障功能障碍的关键因素。活性氧（ROS）的过度积累可损伤细胞大分子并破坏正常信号转导。如图S5所示，LPS刺激24 h使Caco-2细胞内ROS水平显著升高至对照值的约1.5倍。值得注意的是，CG-LS处理抑制了ROS生成，将其降至对照组的0.53倍。CG-LS的抗氧化能力显著优于活CG组（降至0.97倍）和PCG组（降至0.90倍），表明超声释放的成分具有增强的抗氧化活性。屏障修复依赖于健康上皮细胞的增殖和更新。通过流式细胞术分析细胞周期分布（图4A-D）。LPS处理使阻滞在G0/G1期的细胞比例从对照组的59.45%显著增加至72.98%，S期（DNA合成期）细胞相应减少。该结果表明LPS诱导的炎症应激阻碍了正常细胞周期进程。值得注意的是，CG-LS干预有效缓解了这种阻滞，显著将G0/G1期细胞比例降至63.51%，同时最显著地恢复了S期和G2期细胞比例。相比之下，活CG和PCG组对周期阻滞的改善效果较弱（G0/G1期比例分别为62.44%和62.91%）。这些结果表明CG-LS不仅更有效地保护细胞免受氧化损伤，还更显著地促进细胞周期进程，从而加速上皮修复和再生。
【数据】LPS 24h ROS：约1.5倍；CG-LS降低ROS：0.53倍；活CG：0.97倍；PCG：0.90倍；对照组G0/G1期：59.45%；LPS组G0/G1期：72.98%；CG-LS组G0/G1期：63.51%；活CG组：62.44%；PCG组：62.91%
3.4 CG-LS通过激活FOXO通路协调屏障修复
为系统描绘CG-LS屏障修复的核心调控网络，我们进行了转录组学分析。图5A展示了CG-LS治疗组与LPS模型组之间KEGG通路富集的气泡图。结果显示FOXO信号通路是最显著富集的通路之一。进一步分析FOXO通路相关基因的表达变化（图5B-E），CG-LS处理显著上调了FOXO1、FOXO3、SOD2、CAT、CCND1、CDKN1A等基因的mRNA水平。这些基因涉及抗氧化防御（SOD2、CAT）、细胞周期调控（CCND1、CDKN1A）和屏障组装等多个下游网络。为验证FOXO通路的功能重要性，我们使用特异性FOXO1抑制剂AS1842856进行干预。如图5F-H所示，AS1842856处理显著削弱了CG-LS对TEER的恢复作用、对ROS的清除能力以及对紧密连接蛋白表达的促进作用。这些结果证明CG-LS主要通过激活FOXO通路来协调下游基因网络，从而驱动屏障修复。
【数据】KEGG富集：FOXO信号通路最显著；上调基因：FOXO1、FOXO3、SOD2、CAT、CCND1、CDKN1A；AS1842856：0.5μM；FOXO通路抑制削弱CG-LS效果
3.5 CG-LS中L-精氨酸的关键作用
为鉴定CG-LS中的关键生物活性成分，我们进行了非靶向代谢组学分析。图6A展示了基于非靶向代谢组学的氨基酸代谢通路示意图。不同颜色代表代谢物类别，色块大小代表其比例丰度。图6B显示了CG-LS与对照之间的差异代谢物。分析揭示L-精氨酸（L-Arg）是CG-LS中丰度最高的游离氨基酸之一。为验证L-Arg的功能贡献，我们检测了其对角质形成细胞屏障相关指标的影响。如图7A-F所示，L-Arg（0.5 mM）处理6 h显著上调了ZO-1、Occludin-1、Claudin-1、MUC-2和E-钙黏蛋白的mRNA表达，效果与CG-LS处理相似。此外，L-Arg也激活了FOXO通路相关基因（图8A-D），包括FOXO1、FOXO3、SOD2和CAT。为排除其他氨基酸的贡献，我们使用了L-PTH混合物（含L-脯氨酸、L-色氨酸和L-组氨酸，摩尔比2.7:4.5:1.0），该混合物未显示出显著的屏障修复效果。这些结果表明L-Arg是CG-LS中驱动屏障修复的关键生物活性成分。
【数据】L-Arg：0.5mM，6h；上调：ZO-1、Occludin-1、Claudin-1、MUC-2、E-钙黏蛋白；激活：FOXO1、FOXO3、SOD2、CAT；L-PTH：0.5mM，摩尔比2.7:4.5:1.0，无显著效果
讨论与解读
本研究首次系统证明谷氨酸棒杆菌裂解上清液（CG-LS）具有强效肠道屏障保护作用，并阐明了其细胞与分子机制。研究在两方面推进了现有认知：其一，证明裂解液成分本身——无需活菌——足以赋予保护效果，为后生元应用提供了直接证据；其二，鉴定L-Arg为关键生物活性成分，并阐明FOXO通路在此过程中的核心调控作用。需要说明活CG体内效果与CG-LS体外机制研究之间的逻辑关系：部分口服CG可能到达结肠，支持氨基酸的局部释放；结合16S数据中氨基酸代谢富集的结果，促使我们采用Caco-2模型研究直接上皮效应。体外数据确立L-Arg/FOXO1轴为关键机制，为未来CG-LS的体内验证提供了合理基础。研究结果与当代后生元研究趋势高度一致——该领域正逐步从活益生菌转向探索其无细胞组分，以规避活菌制品在稳定性、安全性和标准化方面的固有局限。
编译者解读
该研究的亮点在于"以废为宝"的思路：谷氨酸棒杆菌本是工业氨基酸生产菌，其裂解液却展现出优于活菌的屏障修复能力。方法上，作者用超声破碎获取胞内成分，再通过代谢组学锁定L-Arg、用FOXO1抑制剂验证通路，逻辑链较完整。但体外Caco-2模型无法完全模拟体内复杂微环境，L-Arg的具体受体与FOXO1的上下游调控细节仍有待体内实验证实。对合成生物学而言，这提示可利用工程化谷氨酸棒杆菌定向富集L-Arg或协同抗氧化成分，开发标准化后生元制剂。
参考来源
期刊：Food Research International, 2026
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119630
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119630