来源：Heterologous expression of sfp from Bacillus subtilis enhances colanic acid biosynthesis in Escherichia coli S17-3（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
可拉酸（colanic acid, CA）是大肠杆菌产生的一种胞外多糖，因其持水性、黏弹性和生物活性糖残基而在食品、医药和材料领域受到关注。然而，其高效生物合成的调控基础尚不清楚。本研究在构建1,3-丁二醇合成途径时意外发现CA产量大幅提升，经逐步解析锁定枯草芽孢杆菌来源的sfp基因为关键决定因子。通过比较转录组分析和功能验证，揭示了sfp诱导的广泛代谢重编程及wca基因簇激活，并鉴定出YaiY和YpeC两个此前未被认识的CA合成正贡献因子。
研究背景
细菌胞外多糖在细胞保护、生物膜形成和胁迫适应中发挥重要作用。可拉酸是大肠杆菌产生的胞外荚膜多糖，有助于生物膜稳定性和环境适应性，也有报道参与宿主相关互作，如增强秀丽隐杆线虫的免疫应答。CA还因其持水能力、黏弹性和岩藻糖等生物活性糖残基而备受关注。CA的生物合成途径已被较好表征，其功能主要由wca基因簇编码，依赖胞内核苷酸糖前体形成、重复单元组装以及后续聚合与输出，并受Rcs磷酸 relay系统调控。此前的工程改造通过操纵关键调控因子提高CA产量，如敲除负调控因子Lon以解除阻遏，或过表达RcsA、RcsF等转录调控因子增强途径激活，以及重塑脂多糖生物合成和优化前体供应。尽管如此，CA高效合成的调控基础仍未被充分理解。
研究方法
2.1 菌株、质粒与遗传操作
#### 2.1.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒列于表S1。本研究所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司和北京擎科生物科技有限公司合成。测序服务由擎科生物和上海杰李生物提供。大肠杆菌DH5α用于质粒构建和克隆。本研究所用的非大肠杆菌基因经密码子优化后由生工生物合成。多数情况下，重组质粒采用ClonExpress II一步克隆试剂盒（诺唯赞，南京，中国）配合相应引物通过In-Fusion克隆组装。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α（质粒构建）、大肠杆菌S17-3及其衍生菌株；试剂盒：ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme）；引物合成：生工生物/擎科生物；测序：擎科生物/杰李生物；原文未详述其他具体参数
#### 2.1.2 基因编辑
大肠杆菌基因编辑采用基于双质粒平台pEcCas/pTargetF的CRISPR-Cas9系统，其中pEcCas用于靶基因切割和重组，pTargetF衍生质粒用于引导位点特异性切割。以S17-3-T7ΔyaiY的构建为例：（i）通过重叠延伸PCR融合yaiY位点两侧的1000 bp上游片段和1000 bp下游片段，生成线性双链DNA（dsDNA）修复模板。（ii）通过电穿孔将pEcCas质粒导入S17-3-T7，在含卡那霉素（50 mg/L）的LB琼脂平板上筛选转化子。（iii）采用双引物PCR突变方法构建携带靶向yaiY位点N20序列的pTargetF ΔyaiY质粒，正确构建的质粒经测序确认。（iv）用10 mM L-阿拉伯糖诱导后，通过电穿孔将修复模板和pTargetF ΔyaiY质粒共转化入含pEcCas的感受态S17-3-T7细胞。在含卡那霉素（50 mg/L）和链霉素（50 mg/L）的LB琼脂平板上筛选转化子，正确突变株经测序验证。（v）将突变株在含10 mM鼠李糖的LB培养基中培养以消除pTargetF ΔyaiY质粒，然后稀释涂布于含10 g/L蔗糖的LB琼脂平板以消除pEcCas质粒。本研究涉及的基因N20序列列于表S2。
【数据】上游/下游同源臂：各1000 bp；卡那霉素：50 mg/L；链霉素：50 mg/L；L-阿拉伯糖：10 mM；鼠李糖：10 mM；蔗糖：10 g/L；原文未详述其他具体参数
2.2 培养条件
大肠杆菌单菌落常规接种于Luria-Bertani培养基（LB；10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl），根据需要添加适当抗生素用于筛选和培养（卡那霉素50 mg/L；链霉素50 mg/L）。摇瓶发酵时，除相应抗生素外，添加20 g/L葡萄糖作为碳源，必要时用3 M HCl调节培养基pH。此外，M9Y培养基（0.5 g/L酵母提取物、6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、0.015 g/L CaCl₂·2H₂O、0.49 g/L MgSO₄·7H₂O、2.8×10⁻⁴ g/L FeSO₄·7H₂O和20 g/L葡萄糖）也用于部分菌株的培养。摇瓶培养前，挑取单菌落接种于3 mL含适当抗生素的LB培养基中，37 °C、200 rpm培养16–18 h制备种子液。随后，将0.5 mL种子液接种于50 mL培养基（LB或M9Y）中，37 °C、200 rpm培养。当培养物OD₆₀₀达到约0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM。所有摇瓶实验均设三个平行。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；卡那霉素：50 mg/L；链霉素：50 mg/L；葡萄糖：20 g/L；pH调节：3 M HCl；M9Y培养基：0.5 g/L酵母提取物、6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、0.015 g/L CaCl₂·2H₂O、0.49 g/L MgSO₄·7H₂O、2.8×10⁻⁴ g/L FeSO₄·7H₂O、20 g/L葡萄糖；种子培养：3 mL LB、37 °C、200 rpm、16–18 h；发酵培养：0.5 mL种子液接入50 mL培养基、37 °C、200 rpm；IPTG诱导：OD₆₀₀≈0.5时、终浓度0.5 mM；平行数：3
2.3 分析方法
大肠杆菌培养物的细胞密度通过测定600 nm处光密度估算。发酵液中CA的存在通过乙醇沉淀初步评估。简要而言，取1 mL发酵液在12,000 rpm、4 °C离心，然后将250 μL上清液与无水乙醇按1:4体积比混合以沉淀发酵液中的多糖。发酵液中CA浓度基于岩藻糖含量估算。测定方法如下：将离心后的发酵上清液适当稀释后，取100 μL样品与450 μL 87% H₂SO₄混合，100 °C加热20 min。冷却至室温后，在396和427 nm处测定吸光度。随后加入5.45 μL 6%半胱氨酸盐酸盐溶液（w/v），孵育40 min后再次测定396和427 nm处吸光度。岩藻糖衍生的吸光度信号按ΔA = (A396+Cys − A396−Cys) − (A427+Cys − A427−Cys)计算，其中A+Cys和A−Cys分别代表加入半胱氨酸盐酸盐后和前的吸光度值。吸光度差值与岩藻糖标准曲线比较以确定样品中岩藻糖浓度。经相应稀释倍数校正后，估算CA产量并以岩藻糖当量浓度表示。为进一步分析提取多糖的单糖组成，采用PMP柱前衍生化RP-HPLC。简要而言，取100 μL多糖样品与100 μL 4 mol/L三氟乙酸混合，用N₂冲洗、密封，110 °C水解2 h。冷却后，通过反复加入甲醇并在N₂下干燥去除残留三氟乙酸。干燥残渣溶于50 μL 0.3 mol/L NaOH中，与50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液在70 °C衍生化100 min。反应混合物用50 μL 0.3 mol/L HCl中和，用水稀释至1 mL，用1 mL氯仿萃取。分相后收集水相，经0.45 μm膜过滤后进行HPLC分析。分离在ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm）上进行，流动相为0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.7）和乙腈按83:17体积比混合。柱温维持30 °C，检测波长250 nm，流速1 mL/min，进样量20 μL。
【数据】离心：12,000 rpm、4 °C；上清液：250 μL；无水乙醇体积比：1:4；H₂SO₄浓度：87%；加热：100 °C、20 min；半胱氨酸盐酸盐：5.45 μL、6%（w/v）；孵育：40 min；检测波长：396 nm、427 nm；三氟乙酸：100 μL、4 mol/L；水解：110 °C、2 h；NaOH：50 μL、0.3 mol/L；PMP：50 μL、0.5 mol/L；衍生化：70 °C、100 min；HCl：50 μL、0.3 mol/L；氯仿：1 mL；色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm）；流动相：0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.7）:乙腈=83:17；柱温：30 °C；检测波长：250 nm；流速：1 mL/min；进样量：20 μL
2.4 转录组测序与数据分析
转录组分析中每个菌株设三个生物学重复。菌株A0（LBG/S17-3）、A1（LBG/S17-3-T7O）、A2（LBG/S17-3-T7sfp）和B0（M9YG/S17-3）在相同摇瓶条件下培养，细胞在指数晚期收获。样品通过5,000 rpm、4 °C离心10 min收集。用无菌水洗涤一次后再次离心，弃上清，细胞沉淀立即在液氮中冷冻以备后续RNA提取和测序分析。总RNA使用TRIzol试剂（Invitrogen）按制造商说明提取。RNA纯度和浓度使用NanoDrop分光光度计基于OD260/280比值测定，RNA完整性使用Agilent 2100 Bioanalyzer评估。合格RNA样品用于后续文库构建。文库制备前，从RNA样品中去除rRNA。然后使用TruSeq RNA Sample Prep Kit构建cDNA文库。文库质量通过Qubit 2.0荧光计测定文库浓度和Agilent 2100 Bioanalyzer测定插入片段大小分布评估，文库浓度进一步通过qPCR定量。合格文库按要求混合，在Illumina二代高通量测序平台上测序。原始测序数据在下游分析前进行质量控制。参考基因组和注释文件从NCBI数据库下载（Escherichia coli K−12 S17–1, GCF_005954725.1）。Clean reads比对到参考基因组。
【数据】生物学重复：3；离心收集：5,000 rpm、4 °C、10 min；RNA提取试剂：TRIzol（Invitrogen）；RNA纯度检测：OD260/280（NanoDrop）；RNA完整性：Agilent 2100 Bioanalyzer；文库构建试剂盒：TruSeq RNA Sample Prep Kit；文库浓度定量：Qubit 2.0、qPCR；测序平台：Illumina二代高通量；参考基因组：Escherichia coli K−12 S17–1, GCF_005954725.1
研究结果
3.1 鉴定sfp为促进CA产量的关键因子
在前期研究中，S17-3及其衍生菌株在PHB和柠康酸生产中表现出良好能力，两者均高度依赖乙酰-CoA作为关键前体。鉴于S17-3的这一特性，我们试图在该菌株中构建1,3-丁二醇（1,3-BDO）的异源生物合成途径。目前，已报道多条大肠杆菌中1,3-BDO生物合成路线。最常见的一条涉及硫解酶将乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA，脱氢酶将乙酰乙酰-CoA转化为3-羟基丁酰-CoA（3-HB-CoA），随后通过脱氢酶和醇脱氢酶的序贯作用转化为1,3-BDO。该路线的主要缺点是对CoA结合代谢中间体的强依赖性，将1,3-BDO生产与胞内CoA代谢紧密耦合，从而限制代谢通量并降低调控灵活性。因此，我们尝试模拟Wang等人构建的用于1,3-BDO生产的非CoA依赖途径。如图1A所示，引入来自Cupriavidus necator H16（原Ralstonia eutropha H16）的phaA和phaB催化乙酰-CoA转化为3-HB-CoA。此外，过表达S17-3内源性tesB将3-HB-CoA转化为3-羟基丁酸（3-HB），从而使途径摆脱CoA依赖。随后，使用来自Mycobacterium marinum的羧酸还原酶（CAR）催化3-HB转化为3-羟基丁醛（3-HBAD），后者可被大肠杆菌内源性醇脱氢酶/醛还原酶（ADHs）还原为1,3-BDO。在此过程中，CAR必须经磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPTase）翻译后修饰，从无活性脱辅基酶转化为活性全酶，而来自枯草芽孢杆菌的sfp是一种经典的具有广泛底物特异性的PPTase。基于此设计，我们构建了携带phaA、phaB、tesB、car和sfp的质粒pET28a-TP-CS（图1A），并将其导入携带T7表达系统的S17-3衍生菌株，获得S17-3-T7/TP-CS。随后在LB培养基中以葡萄糖为碳源进行摇瓶发酵。然而出乎意料的是，S17-3-T7/TP-CS的发酵液变得黏稠。发酵上清液的乙醇沉淀是判断多糖是否存在的常用初步方法。对S17-3-T7/TP-CS和S17-3-T7O（携带pET−28a(+)的菌株）的发酵液进行乙醇沉淀后，S17-3-T7/TP-CS的发酵液在加入乙醇后清晰观察到絮状和聚集的沉淀，而S17-3-T7O未观察到此类现象（图1B）。S17-3-T7/TP-CS发酵液中CA滴度达到4.39 g/L，而S17-3-T7O仅为0.18 g/L（图1C）。此外，在S17-3-T7/TP-CS发酵液中未检测到1,3-BDO及其前体3-HB，表明该菌株的碳通量并未有效导向1,3-BDO生物合成途径。相反，引入的途径似乎含有刺激因子诱导了S17-3-T7中多糖的产生。基于我们此前对S17-3的研究，该多糖被鉴定为可拉酸（CA），一种由大肠杆菌K−12产生的荚膜多糖。为进一步支持该鉴定，将提取的多糖水解后通过PMP柱前衍生化RP-HPLC分析单糖组成。水解样品显示出对应于CA特征性单糖组分的峰（图S1）。随后逐一去除pET-TP-CS中的每个基因，以确定引入途径中哪个组分负责刺激CA产生。基于此策略，构建了五个衍生菌株，即S17-3-T7/dcar、S17-3-T7/dsfp、S17-3-T7/dtesB、S17-3-T7/dphaA和S17-3-T7/dphaB，并在相同条件下培养比较（图1A）。如图1B的乙醇沉淀实验清楚显示，仅当从质粒中删除sfp时（即S17-3-T7/dsfp），才观察到多糖产生的丧失。在生长方面，删除sfp对菌株影响不大，因为所有衍生菌株的OD₆₀₀值均保持在6–7范围内（图1D）。相比之下，发酵液中CA定量显示S17-3-T7/dsfp仅产生0.22 g/L CA，与S17-3-T7O水平相当，明显低于其他衍生菌株（图1C）。这些结果表明sfp表达是触发该系统中CA产生的关键因子。通过构建单独表达sfp的菌株S17-3-T7/sfp进一步验证了这一结论（图1A）。正如预期，单独表达sfp足以诱导CA产生，且CA滴度甚至高于其他衍生菌株，达到6.24 g/L。该结果不仅证实sfp是CA产生表型的主要决定因子，还表明S17-3-T7/sfp中的碳通量比S17-3-T7/TP-CS等菌株更有效地导向CA生物合成途径。
【数据】质粒：pET28a-TP-CS（携带phaA、phaB、tesB、car、sfp）；菌株：S17-3-T7/TP-CS、S17-3-T7O、S17-3-T7/dcar、S17-3-T7/dsfp、S17-3-T7/dtesB、S17-3-T7/dphaA、S17-3-T7/dphaB、S17-3-T7/sfp；CA滴度：S17-3-T7/TP-CS 4.39 g/L、S17-3-T7O 0.18 g/L、S17-3-T7/dsfp 0.22 g/L、S17-3-T7/sfp 6.24 g/L；OD₆₀₀：所有衍生菌株6–7；1,3-BDO和3-HB：未检测到
为确定该现象是否为PPTase过表达的普遍结果，我们选取了大肠杆菌K−12的三个内源性PPTase进行过表达：AcpS，参与从头脂肪酸生物合成的PPTase；以及两个Sfp型PPTase，EntD，功能为肠杆菌素生物合成；和AcpT，其生理角色尚未明确界定（图2A）。出乎意料的是，过表达这三个PPTase均不能刺激菌株产生CA。乙醇沉淀结果显示，S17-3-T7/acpS、S17-3-T7/acpT和S17-3-T7/entD发酵液中均未观察到明显CA积累（图2B），相应CA滴度仅为0.16、0.18和0.17 g/L（图2C）。此外，与S17-3-T7/sfp相比，所有过表达内源性PPTase的菌株均表现出不同程度的细胞密度降低，表明acpS、acpT或entD的过表达对S17-3-T7造成了一定生理负担（图2D）。早期生化研究已证实，Sfp可在体外磷酸泛酰巯基乙胺化异源载体蛋白，包括大肠杆菌EntB的芳基载体蛋白（ArCP）结构域和大肠杆菌ACP。Sfp–CoA复合物和肽基载体蛋白（PCP）/Sfp复合物的结构分析进一步表明，Sfp的底物识别与载体蛋白的保守结构特征和疏水接触相关，特别是涉及载体蛋白第二螺旋和Sfp C端结构域的接触，而非仅由严格的一级序列特异性决定。因此，具有兼容整体折叠、保守靶标丝氨酸残基以及与Sfp活性位点有利空间排列的载体蛋白，可能作为Sfp介导磷酸泛酰巯基乙胺化的合理底物。综上所述，这些结果表明，作为一种具有更广泛底物特异性的PPTase，Sfp最可能激活了S17-3-T7中通常不被内源性PPTase修饰的底物，从而刺激该菌株大量分泌CA。
【数据】过表达菌株：S17-3-T7/acpS、S17-3-T7/acpT、S17-3-T7/entD；CA滴度：acpS 0.16 g/L、acpT 0.18 g/L、entD 0.17 g/L；细胞密度：所有过表达内源性PPTase菌株较S17-3-T7/sfp均有不同程度降低
此外，在我们此前的研究中发现，培养基初始pH对S17-3衍生菌株的CA产量有相当大的影响。为探究S17-3-T7/sfp的CA产生能力是否同样受培养基初始pH影响，将该菌株在初始pH值为4.5、5.0、5.5和6.0的条件下培养。结果显示，较低的……
讨论与解读
本研究意外发现，异源表达枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp可在大肠杆菌S17-3衍生菌株中触发显著的CA积累，而内源性大肠杆菌PPTase的过表达不产生类似表型。在酸性初始培养条件下CA产量进一步提高，pH 4.5时最高滴度达10.53 g/L。比较转录组分析揭示，sfp表达伴随广泛的细胞重编程，包括wca基因簇和核苷酸糖前体供应途径的协同上调，以及碳水化合物代谢、脂质代谢和包膜相关功能的显著变化。功能验证进一步鉴定出yaiY和ypeC为CA积累的正贡献因子，过表达这些基因促进CA产生，而在sfp表达背景中敲除则显著降低CA滴度。这些结果支持一个工作模型：异源Sfp并非通过单一决定因子促进CA生物合成，而是通过协调的代谢和包膜相关重塑增强前体供应、激活CA生物合成/输出，并涉及YaiY和YpeC等辅助因子。
编译者解读：该研究以"意外发现"为起点，通过逐步拆解异源途径锁定sfp单基因足以驱动CA大量积累，方法设计简洁而逻辑严密。比较转录组与功能验证相结合的策略有效缩小了候选范围，YaiY和YpeC的鉴定为CA合成调控网络增添了新节点。然而，Sfp具体激活了哪些载体蛋白底物、其与CA合成途径的分子连接机制仍未完全阐明。从合成生物学角度看，sfp作为一个单基因开关即可大幅提升多糖产量，具有作为通用底盘改造工具的潜力，但需警惕其广泛底物特异性可能带来的代谢负担与副产物问题。
参考来源
期刊：Enzyme and Microbial Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110925
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110925